实验性自身免疫性重症wonca研究

实验性自身免疫性重症wonca研究

重症无力（mg）是b细胞诱导和依赖t细胞的自身免疫性疾病之一。cd4-t细胞亚型之间的平衡变化决定了该病的结局，在疾病机制中起着非常重要的作用。以往对MG发病机制的研究认为,Th1和Th2细胞之间功能失衡致使疾病发生,但随着Th17/Treg等新亚型的发现,又有了新的解释。本研究采用MG的实验动物模型观察实验性自身免疫性重症肌无力(Experimentalautoimmunemyastheniagravis,EAMG)发病过程中,Th1/Th2/Th17/Treg细胞之间的相互关系,以期阐述EAMG发病过程中B细胞抗体分泌机制。1.材料和方法1.1实验动物与材料SPF级纯系健康雌性Lewis大鼠,6~8周龄,体重160~180g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠自由食水,昼夜12h交替光照,室温条件下饲养。1.2国际专利剂和标准R-AChRα97-116肽段购自西安联美生物科技有限公司;结核菌素购自美国DifcoLaboratories公司;ELISA试剂盒购自上海森雄(中国)公司;不完全弗氏佐剂(IFA)购自美国Sigma公司;BFA和PE-antiratFoxp3购自美国eBioscience公司;PMA和Inomycin为美国ALEXISBiochemicals公司产品;FITC-antiratCD4、PE-antiratIFNγ和PE-antiratIL-4购自美国BD公司;Rabbitanti-ratIL-17购自美国SantaCruzBiotechnology公司;PE-Cy3anti-rabbitIgG购自美国Caltag公司。1.3各组大鼠的免疫将Lewis大鼠随机分为完全弗氏佐剂(CFA)早、晚期发病时对照相和EAMG早期(初次免疫后13d)、高峰期(初次免疫后50d)发病时相4组,每组8只。经乙醚麻醉后,EAMG组每只大鼠以含50μgR-AChRα97-116肽段、1mg结核菌素和100μlIFA的200μlPBS经尾根部皮下免疫,于免疫后第30天,以含50μgR-AChRα97-116和100μlIFA的200μlPBS经尾根部皮下追加免疫;CFA组大鼠免疫方法同EAMG组,其中以PBS取代R-AChRα97-116。初次免疫后,依据临床评分标准,每两天进行体重测量和临床体征评定。1.4研磨预处理无菌条件下剪开大鼠腹部、腿部皮肤,取出肿大的腹股沟、腘窝、腹主动脉旁淋巴结,去除表面脂肪和被膜,置于研磨网上,用5ml注射器内芯做圆周运动在研磨网上研磨,直至纤维组织留下。再用5ml注射器(带针头)来回吹打液体几次,将大的组织团块分散开,制成单细胞悬液,收集至离心管内,4℃,2500r/min离心10min后弃上清,沉淀经漩涡振荡器振荡,使其变得疏松,用10mlHBSS洗涤细胞1次,4℃,2500r/min离心10min,EAMG淋巴细胞培养液重悬细胞,200μm目尼龙网过滤,收集单细胞悬液,台盼蓝染色法检测细胞活性(应大于90%)。1.5细胞诱导染色于发病早期和高峰期分离CFA和EAMG组大鼠淋巴细胞,在R-AChRα97-116肽段刺激下体外培养3d,FACS法检测CD4+T细胞亚型的差异。染色前,在细胞培养液中加入BFA(1∶1000稀释)、PMA(20ng/ml)和Inomycin(1μg/ml),孵育4h;用FITC-antiratCD4进行CD4染色;固定破膜后,分别加入PE-antiratIFNγ、PE-antiratIL-4、PE-antiratFoxp3和Rabbit-antiratIL-17一抗,及PE-Cy3anti-rabbitIgG二抗,上流式细胞仪检测。1.6elisa测定细胞培养中il-4、tgf-及il-6含量将CFA和EAMG组发病早期和高峰期的淋巴细胞(2×106个/ml)分别在R-AChR的刺激下体外培养3d,收集细胞培养上清,用ELISA试剂盒检测IFNγ、IL-4、IL-17、TGF-β及IL-6的含量,操作按试剂盒说明进行。1.7统计分析应用SPSS13.0软件处理实验数据,数据用ue0af±s表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。2.结果2.1treg细胞比例变化经流式细胞仪检测,两组Th1(CD4+IFNγ+)、Th2(CD4+IL-4+)、Th17(CD4+IL-17+)和Treg(CD4+Foxp3+)细胞的比例变化及分布见图1。与CFA组相比,EAMG组Th1、Th2和Th17细胞的百分比下降,Treg细胞的百分比升高,但差异均无统计学意义(t值分别为1.953、0.263、2.220和1.302,P值分别为0.987、0.813、0.068和0.240),见表1。2.2il-6含量的比较检测结果显示,EAMG组细胞培养上清中IFNγ和IL-4的含量明显低于CFA组(t值分别为5.225和11.631,P值分别为0.0020和0.0001);IL-6的含量明显高于CFA组(t=26.465,P=0.0001);IL-17和TGF-β的含量与CFA组相比,差异无统计学意义(t值分别为2.302和1.762,P值分别为0.0609和0.1281)。见表2。2.3细胞、trad和treg细胞比例对比的影响经流式细胞仪检测,两组Th1、Th2、Th17和Treg细胞的比例变化及分布见图2。与CFA组相比,EAMG组Th1和Th17细胞的百分比明显升高(t值分别为2.578和15.214,P值分别为0.0275和0.0001);Th2和Treg细胞的百分比明显下降(t值分别为5.357和5.366,P值分别为0.0003和0.0003)。见表3。表明在EAMG发生过程中,辅助性T细胞亚型之间的平衡失调,表现为致炎性细胞(Th1、Th17)比例上调,抑炎性细胞(Th2、Treg)比例下降。2.4il-4和tgf-含量检测结果显示,EAMG组细胞培养上清中IFNγ和IL-17含量明显高于CFA组(t值分别为3.253和3.451,P值分别为0.0172和0.0136);IL-4和TGF-β含量明显低于CFA组(t值分别为9.059和8.337,P值分别为0.0001和0.0002);IL-6含量与CFA组相比,差异无统计学意义(t=0.372,P=0.7226)。见表4。3.cd4+t细胞亚型在eage中的作用在大鼠EAMG模型的发病过程中,会有两个阶出现临床期症状,第1时相出现在初次免疫后的第13天左右,表现为食欲减退、活动减少及轻微的无力症状,但持续4d左右即可自动恢复。Lewis大鼠EAMG发病的早期症状是由巨噬细胞在突触后膜的聚集所引发的,而浸润的巨噬细胞的凋亡是症状缓解的主要因素。第2时相(即疾病的高峰期)出现在初次免疫后的第50天左右,这时大鼠由食欲减退、活动减少,逐渐发展为全身静止状态下的肌无力,随着时间的延长而加重,最终导致死亡。与前一阶段不同的是,这个阶段的临床症状是由于机体内产生了针对自身抗AChR的抗体,是自身免疫性疾病发生的根本原因。众所周知,B细胞是产生抗体的淋巴细胞,而研究表明,AChR特异性辅助性CD4+T细胞亚型通过其分泌的细胞因子及协同刺激信号的激活,可诱导B细胞特异性抗体的分泌,在MG/EAMG的发病过程中发挥了重要作用。以往CD4+辅助性T细胞亚型按其分泌的细胞因子或表达的转录因子的不同分为Th1细胞(CD4+IFNγ+)、Th2细胞(CD4+IL-4+)和Treg细胞(CD4+Foxp3+),它们是通过分泌特异性细胞因子起到免疫调节作用。Th1细胞的主要效应因子IFNγ被证实在器官特异性自身免疫性疾病的起始和发展阶段都是必不可少的。在EAMG中,将IFNγ转基因定位于神经-肌肉接头处或体外给予IFNγ,均可加重临床症状,而IFNγ基因敲除鼠对EAMG的发生具有耐受性。然而,对Th2细胞及IL-4在EAMG中作用的研究却出现了争议,Balasa等指出,IL-4在EAMG中是非必需的;但Milani等却提出,IL-4能够阻止EAMG的发生,对慢性自身免疫性疾病有促进好转的作用。Treg细胞是另外一类独立鉴定的CD4+T细胞亚型,被证实与自身免疫性疾病的耐受有关。给予肌无力大鼠体外富集的Treg细胞可以抑制EAMG的发病进程,体液免疫中AChR的特异性反应降低,同时脾组织中表达Foxp3的CD4+CD25+细胞的数量显著上调。其他研究小组证实,Treg细胞的主要效应因子TGF-β与EAMG的免疫耐受密切相关。另外一种新的辅助性CD4+T细胞亚型Th17及其主要效应因子IL-17已被证实具有促炎性作用,并且在自身免疫性疾病的发病过程中起到了非常重要的作用,在EAMG的发生和发展过程中已经证实,Th17细胞参与了EAMG的发生,并发挥了免疫调节的作用。本研究显示,在疾病发生的早期阶段,Th1、Th2、Th17细胞比例下降,而Treg细胞比例上升;细胞因子IFNγ和IL-4含量下降,而IL-17、TGF-β和IL-6含量升高,说明初始化CD4+T细胞在TGF-β和IL-6的刺激下已发生向Th17细胞的转化,同时抑制了向Treg细胞的转化,且这4种辅助性CD4+T细胞的亚型网络格局已