hplc-elsd法测定注射用头孢曲松钠中钠离子含量及成盐率

hplc-elsd法测定注射用头孢曲松钠中钠离子含量及成盐率

氨基乙醇钠（cefticsoud，c18h16n8na2o7s2，又名三羟色胺）是1978年瑞沙罗公司开发的第三代类抗生素。具有光谱强、抗酶性低、半衰期长（7.9h）、组织透水性强等特点，临床应用广泛。国内目前已经有几十家药品生产企业生产。有文献报道,不同企业生产的注射用头孢曲松钠临床疗效差异,可能是蛋白结合率差异所致。对注射用头孢曲松钠蛋白结合率的测定方法,国内外均有文献报道,有采用分子荧光法、光谱法、毛细管电泳法(CE)等方法直接测定,尚未见液相色谱法报道。当头孢曲松钠成盐完全时,钠原子(Na)与头孢曲松酸(C18H18N8O7S3)的摩尔比应为2:1。在以前研究中已经证明,成盐不完全的头孢曲松钠,往往由于含有过多的游离头孢曲松酸而导致血浆蛋白结合率偏高从而使得起效时间延长(图1)。因此可通过HPLC法测定头孢曲松钠中钠离子与活性成分的摩尔比,计算成盐程度,进而推测成盐率差异可能引起蛋白结合率不同的原因之一。目前,测定药物活性成分中钠离子的办法主要有:原子吸收分光光度法、HPLC-ELSD法、离子色谱法、ICP-MS、CE法等。其中,原子吸收分光光度法样品前处理步骤多,常常引入系统误差;离子色谱法需要价格昂贵的阴(阳)离子交换色谱柱以及相配套的电导检测器、离子抑制器等设备,难以推广;ICP-MS前处理步骤多,灵敏度很高,常常受玻璃仪器、实验用水等残留钠离子干扰,导致误差较大:CE法能同时实现阴离子、阳离子、中性分子的分离,因具有快速、高效、前处理简单等优点在小离子分离领域已大量替代了离子色谱法,广泛用于国外制药工业。近年来,随着色谱公司新型分离填料的发展,在分离分析复杂体系样品时,单一模式的色谱柱已经不能满足需要,混合模式色谱柱(mixed-modecolumn)应运而生。根据文献资料,美国DIONEX公司生产的两性离子交换-反相-亲水作用混合模式色谱柱(ZIC-RP-HILIC,zwitterionexchangereversedphase-hydrophilicinteractionmixed-modecolumn),在高比例有机相条件下具有亲水作用模式,可同时分离酸性、碱性和中性药物以及各自成盐离子的混合物,在色谱分离后,采用通用的质量型蒸发光散射检测检测器(ELSD)进行检测,新建了HPLC-ELSD法,测定注射用头孢曲松钠中钠离子含量;同时采用HPLC-UV法测定注射用头孢曲松钠中头孢曲松酸含量,计算出不同工艺样品中头孢曲松钠的成盐程度,将其结果与CE法测定的蛋白结合率比较,讨论了头孢曲松成盐率与蛋白结合率的相关性,尝试用液相色谱法评价小分子药物与体内蛋白作用的可行性。1仪器和试剂盒1.1高效液相色谱条件Dionex液相色谱系统(包括P680型双三元输液泵,ASI100型自动进样系统,PDA100型二极管阵列检测器,TCC-100型柱温箱,Chromleon色谱工作站软件),美国Dionex公司;岛津20A液相色谱系统(包括LC-10AT型双输液泵,DGU-12A型在线脱气机,SIL-10A型自动进样器;CTO-10A型柱温箱;SPD-10A型紫外检测器,Alltech蒸发光散射检测器,数据处理软件为CLASS-VP),日本岛津公司,Milli-Q超纯水系统,法国Millipore公司。1.2头孢曲松杂质c对照品,为试剂治理废水注射用头孢曲松钠样品5批,分别为A厂(09030302);B厂(0905082);C厂(0904244);D厂(20090519),E厂(SH1121),均为2010年国家监督抽验样品。氯化钠工作基准品(NaCl,工作基准品级别,含量99.95%~100.05%,以100.0%计,批号:20000318,由北京益利精细化学品有限公司提供);头孢曲松杂质C对照品(2-甲基-3-巯基-1,2-二氢-1,2,4-三嗪-5,6-二酮,俗称三嗪环,国家对照品,含量99.1%,批号:130611-201001,由中国食品药品检定研究院提供);头孢曲松对照品(国家对照品,含量84.1%,批号:130480-200302,由中国食品药品检定研究院提供);醋酸铵(CH3COONH4,AR级别,含量≥99.5%,批号:20080126,由国药集团化学试剂有限公司提供);氯化钾(KCl,AR级别,含量≥99.5%,批号F20100713,由国家集团化学试剂有限公司提供);硫酸锂(Li2SO4·H2O,AR级别,含量≥99.0%,批号:20060405,由天津市禄晨化学试剂厂提供);无水氯化钙(CaCl2,AR级别,含量≥96.05%,批号F20070731,国药集团化学试剂有限公司提供);冰醋酸(CH3COOH,AR级别,含量≥99.5%,批号:20091020,由北京化工厂提供);乙腈(CH3CN,色谱纯,含量≥99.9%,批号:100606,由FisherScientific提供)。2实验方法2.1对照品储备液的制备取氯化钠工作基准品(含量以100.0%计)适量,置105℃干燥至恒重后,精密称定76.01mg,置100mL量瓶中,用60%乙腈水溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液(以钠离子计,浓度为299.01μg/mL);另精密量取对照品储备液1.0mL,分别置100、50、25、10和5mL量瓶中,用50%乙腈水溶液依次稀释至刻度,摇匀,分别制成从低浓度到高浓度的系列对照品溶液(以钠离子计浓度分别为2.990、5.980、11.96、29.90、59.80μg/mL)。2.2供试品溶液的制备取供试品细粉约12.5mg,精密称定,置25mL量瓶中,用60%乙腈水溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液作为供试品溶液(浓度为0.5mg/mL)。2.3头孢曲松钠的含量测定色谱条件A:用于测定注射用头孢曲松钠中活性成分(头孢曲松酸)含量,与中国药典2010年版二部一致。I号色谱柱为DiamonsilC18(4.6mm×150mm,5μm),S/N8135658;II号色谱柱为VenusilXBPC18(L)4.6mm×250mmS/N:V9520525BH0021,购自天津艾杰尔科技有限公司,柱温为室温,流动相为0.02mmol/L正辛胺溶液-乙睛(73:27,V/V),用磷酸调节pH值至6.5;流速为1.0mL/min;进样器温度为4℃,进样体积为20μL;紫外检测器(200~400nmPDA检测器),检测波长为254nm。取头孢曲松对照品和头孢曲松反式异构体对照品各22mg,置100mL量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度。头孢曲松峰和头孢曲松反式异构体峰之间的分离度应不小于6.0。此色谱条件源于中国药典,不再进行方法学验证。色谱条件B:用于测定注射用头孢曲松钠中钠离子含量。Ⅲ号色谱柱为混合模式色谱柱AcclaimTrinityP1(3.0mm×100mm,5μm),购自美国Dionex公司,LotNo.006-04-062;Ⅳ号色谱柱也是AcclaimTrinityP1(3.0mm×100mm,5μm),购自美国Dionex公司,LotNo.006-04-031;以30mmol/L醋酸铵缓冲盐(取醋酸铵4.59g,加水1900mL使溶解,用冰醋酸调节pH至5.21,加入乙腈100mL)-乙腈(50:50,V/V)为流动相,流速为0.3mL/min;柱温为25℃;以Alltech蒸发光散射检测器检测,漂移管温度:90℃,氮气作为载气,流速为5.3kg/cm3。在色谱图中,钠离子主峰的保留时间约6min,钠离子峰与氯离子峰的分离度应大于10。此方法为新建方法,需要方法学验证。色谱条件C:此色谱条件专用于实验完成后冲洗头孢曲松酸,以200mmol/L醋酸铵缓冲盐(取醋酸铵30.6g,加水1900mL使溶解,用冰醋酸调节pH至4.83,加入乙腈100mL)为流动相,流速、柱温、检测器等其他参数同色谱条件B,此色谱条件仅用于色谱柱保养,不需要进行方法学验证。3结果3.1钠离子含量测定中采用的方法因HPLC测定注射用头孢曲松钠中头孢曲松含量的实验方法与中国药典2010年版的含量测定结果一致,不再进行方法学验证,仅对HPLC-ELSD法测定钠离子含量的方法进行了方法学验证。3.1.1降解头孢曲松钠离子峰精密称定氯化钾11.75mg、氯化钠基准品17.60mg、硫酸锂12.05mg、碳酸氢钠10.50mg、无水氯化钙29.02mg、头孢曲松杂质C对照品10.37mg、头孢曲松对照品15.05mg,分别置10mL量瓶中,分别用60%乙腈水溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,分别进样上述各溶液以确定各离子峰位;精密量取上述各溶液1mL,置10mL量瓶中,用60%乙腈水溶液溶解并稀释至刻度,摇匀;将上述降解溶液进样,分析记录色谱图值至钠离子峰保留时间的3倍。结果显示:可能存在的其他阳离子如Li+、K+、Cl-以及质子化三嗪杂环(头孢曲松杂质C)与钠离子基线分离(图2),Ca2+、SO42-、HCO3-在此色谱条件下不洗脱,不干扰钠离子测定(表1)。3.1.2色谱条件下,头孢曲松峰的测定分别取供试品溶液、氯化钠对照品溶液进样,结果见图3,钠离子峰与氯离子峰之间的分离度为18.53,在此色谱条件下,头孢曲松峰吸附到色谱柱内,不干扰钠离子测定。当实验完成后,用色谱条件C(200mmol/L醋酸铵缓冲盐)冲洗色谱柱时,才能将吸附在色谱柱内的头孢曲松酸洗脱出(图4),推测可能在此情况下头孢曲松呈二价离子状态并且与填料中离子交换基团结合较强有关。3.1.3a对k-l-4-三氢氧降解产物25和3.2.取供试品溶液5份,每份各5mL,分别进行(a)热降解(110℃加热1h)、(b)碱破坏(加0.1mol/L氨溶液1mL,室温放置10min,用0.1mol/L盐酸溶液调节pH值至7.0);(c)氧化降解(加30%过氧化氢溶液0.1mL,室温放置1h);(d)酸破坏(加0.1mol/L盐酸溶液1mL,室温放置10min,调节pH值至7.0);(e)光照降解(紫外灯照射24h后),将上述降解溶液进样,分析记录色谱图值至钠离子峰保留时间的3倍,结果各破坏条件下的降解产物均与钠离子峰分离良好(图5)。上述实验结果表明,头孢曲松主峰不干扰钠离子峰的测定,头孢曲松在热、碱、氧化、酸、紫外光照条件下产生的降解产物峰与钠离子分离良好,从而证实了方法的专属性好;3.2钠离子进样浓度计算分别精密吸取“2.1”项下的对照品溶液(即含相当于钠离子2.990,5.980,11.96,29.90,59.80μg/mL)从低浓度到高浓度依次进样,进样体积为20μL,记录色谱峰面积,以钠离子浓度为横坐标、峰面积为纵坐标,进行线性回归,得出二阶多项式回归方程以及范围,结果表明钠离子进样浓度在2.990~59.80μg/mL范围内呈二项式相关关系。3.3标准曲线及方法精密量取对照品溶液2.990μg/mL0.5mL置100mL容量瓶中,加60%乙腈水溶液稀释至刻度,摇匀,用0.45μm滤膜滤过,取续滤液按上述色谱条件进样20μL,信噪比约为10:1,定量限为1.97μg/mL;检测限为0.65μg/mL。3.4精密度3.4.1标准品溶液进样稳定性测定取“2.4”项下浓度为11.96μg/mL的对照品溶液,连续进样6次,记录钠离子峰的保留时间和峰面积,RSD(n=6)分别为0.52%和0.48%。3.4.2钠离子含量测定取注射用头孢曲松钠样品E厂(批号为SH1121)约12.5mg,精密称定,分别按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液,由不同实验室、不同仪器、不同实验人重复测定,进样20μL,记录钠离子峰面积,计算钠离子平均含量为7.41%,RSD(n=6)为4.32%。3.4.3溶液配制取注射用头孢曲松钠样品E厂(批号为SH1121)约12.5mg,精密称定,分别按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液,进样20μL,记录钠离子峰面积,平均值为7.39%,RSD(n=6)为6.47%。3.5溶液稳定性试验取注射用头孢曲松钠样品E厂(批号为SH1121)约12.5mg,精密称定,分别按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液,室温静置,在上述条件下于0,4,8,12,16和24h依法进样20μL,记录钠离子峰面积RSD为4.99%(n=6),结果表明供试品溶液在24h内稳定。3.6价格精度3.6.1加样回收率试验采用加样回收率试验进行准确度测定。取注射用头孢曲松钠样品E厂(批号为SH1121)约12.5mg,精密称定,分别精密加入钠离子浓度为394.01μg/mL的对照品溶液1.0,2.0和5.0mL,分别相当于加入钠离子0.343,0.686和1.714mmol/mL)分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液,每个浓度平行操作3次,依法测定,计算回收率,平均回收率分别为110.0%、104.1%、107.1%,RSD分别为9.0%、1.7%、4.6%(n=3)。3.6.2方法回归率将同批次样品用原子吸收分光光度法测定结果,以2个方法测定结果的比值作为回收率,以评价新建HPLC-ELSD法的准确度。3.7gc-ms色谱条件选择由2个实验者在不同天用Waters2695型液相色谱仪(A)以及DionexP680液相色谱仪(B),分别用Ⅲ号和Ⅳ号色谱柱进行实验,均得到了类似的HPLC色谱图,钠离子峰和氯离子峰分离良好,峰形正常,显示方法具有比较充分的色谱耐用性。3.8计算成盐率的确定按“2.2”项下方法,每个样品平行制备两份供试品溶液。在上述色谱条件下,分别精密量取对照品溶液(以钠离子计浓度分别为2.990,5.980,11.96,29.90和59.80μg/mL)与供试品溶液各20μL进样,记录钠离子峰面积,按二阶多项式回归方程计算供试品溶液中含钠离子的量,结果见表2及图1,以下式计算成盐率:成盐率计算公式:%=(钠离子%/22.99)/(头孢曲松酸%/554.59)4色谱柱的检测方法混合模式色谱柱(mixed-modecolumn)是将不同的填料和官能团杂交在一根色谱柱上,应用不同的分离机理,同时分离性质差异较大的化合物。目前,混合模式色谱柱主要包括:反相/阴离子交换色谱柱、反相/阳离子交换色谱柱、反相/亲水作用色谱柱、两性离子交换色谱柱、阴(阳)离子交换/亲手性色谱柱、阳离子交换/手性色谱柱、两性离子交换/亲水性色谱柱和两性离子交换/反相色谱柱/亲水作用色谱柱等。本文所选择的色谱柱AcclaimTrinityP1(3.0mm×100mm,5μm)属于两性离子交换-反相-亲水作用混合模式色谱柱,是在硅胶颗粒内孔表面用有机层修饰,键合烷基链和强阴离子交换基团,而在硅胶颗粒外表面键合烷基碳链和弱阳离子交换基团。由于同时存在烷基碳链基团、阴离子以及阳离子交换基团的存在,该色谱柱具有离子交换和反相双重作用模式,在高比例有机相条件下具有亲水作用模式,可同时分离酸性、碱性和中性药物以及各自成盐离子的混合物。由此可以看出,在色谱分离后,应采用通用性强的检测器予以测定,才能最大程度地发挥此类型色谱柱的优势。目前在国外研究中,有报道采用Corona®CAD检测器,CAD检测器为最新开发出来的检测器,具有灵敏度高、通用性好等特点,但价格昂贵、维护成本高;而蒸发光散射检测检测器(ELSD)也是通用性好的质量型检测器,因此,本文拟考虑建立通用性很广的分析方法,用于测定化学药物活性成分中成盐离子的含量,例如Na+、K+、Ca2+、NH4+、Cl-、Br-等的测定,同时通过计算成盐率以监测药物活