第十章 基因工程相关技术

第十章

基因工程相关技术

第一节核酸分子杂交技术第二节芯片技术第三节蛋白质组学与酵母双杂交第四节基因敲除技术第五节生物信息学本章内容第一节核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术是根据核酸变性和复性的性质，应用核酸探针检测靶基因或靶序列的技术方法，是分子生物学领域应用最为广泛的技术之一。具有灵敏度高、快捷、简便易行等优点，被广泛应用于基因克隆的筛选、酶切图谱的制作、基因序列的定量和定性分析以及基因突变的检测等。一、核酸杂交的原理利用具有同源性的两条核酸单链在一定的条件下退火，可按碱基互补原则形成双链，如果这两条链的来源不同，则形成杂交分子，形成的杂交分子的稳定性与两条链的互补性（亲缘关系）密切相互。因此，DNA/RNA的杂交可以用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系，而核酸分子杂交更重要的是可以用来检测核酸片段中某一特定基因的位置。一、核酸杂交的原理核酸分子杂交实验通常包括两步：第一，将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹（nucleicacidblotting）转移。主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法（dotandslotblotting）、菌落和噬菌斑印迹法（colonyandplaqueblotting）；第二，将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸分子杂交为印迹杂交。二、核酸探针的制备核酸分子探针:是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，因此可以用于待测核酸样品中特定基因顺序的探测。要实现对核酸探针分子的有效探测，必须将探针分子用一定的示踪物（即标记物）进行标记。

1.探针的种类及其选择根据核酸分子探针的来源及其性质可以分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡核苷酸探针等几类。探针的选择应给予足够的重视并遵循如下原则：探针应具有高度特异性、来源要尽量方便、探针的序列结构应不受标记物的影响等。1.探针的种类及其选择(1)基因组DNA探针。克隆化的各种基因片段是最广泛采用的核酸探针，几乎所有的基因片段都可被克隆到质粒或噬菌体载体中，为获得大量高纯度的DNA探针提供了方便。近年来发展起来的聚合酶链式反应(PCR)也为DNA探针提供了另一方便的来源。(2)cDNA探针。cDNA中不存在内含子及其他高度重复序列或非编码序列，是一种较为理想的核酸探针，但cDNA探针不易获得，限制了它的广泛应用。另外，要注意cDNA中的poly(dT)可能产生的非特异性杂交问题。1.探针的种类及其选择(3)RNA探针。mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想的，因为：①RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳定性高，因此杂交反应可以在更为严格的条件下进行(如杂交温度可提高10℃左右)，因而杂交的特异性更高。②单链RNA分子不存在互补双链的竞争性结合，与待测核酸序列杂交的效率较高。③RNA中不存在高度重复序列，非特异性杂交也比较少。④杂交后可用RNase将未杂交的探针消化掉，从而使本底降低。1.探针的种类及其选择(3)RNA探针。mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想的。另外，RNA极易被环境中大量存在的核酸酶降解，很难操作，这也是限制其广泛应用的重要原因之一。1.探针的种类及其选择(4)寡核苷酸探针。近年来，随着DNA合成仪的问世及其使用的逐步推广，越来越多的研究者更热衷于采用人工合成的寡聚核苷酸片段作为分子杂交的探针，其优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响；大多数寡核苷酸探针长度只有5~30bp，即使有一个碱基不配对也会显著影响其熔解温度(Tm)，因此特别适合于基因点突变分析；另外，由于探针序列的复杂性降低，杂交所需时间也较短。2.各种标记物及其选择一种理想的探针标记物，应具备以下几种特性：①标记前后探针的基本结构不变，标记物不影响探针的化学性质、杂交特异性、Tm值等；②可以通过采取一定措施达到较高的灵敏度（如延长曝光时间或用增感屏来增加讯号的强度）；③特异性强、本底低，重复性好，并且操作简单、省时；④稳定、安全、经济、无污染。2.各种标记物及其选择目前用于分子杂交的探针标记物已有20多种，可分为放射性和非放射性两大类。1.放射性核素

放射性核素的灵敏度极高，可检测到10－4~10－18g的物质，但存在以下缺点：①容易造成放射性污染；②当标记活性极高时，放射线会造成核酸分子结构的破坏；③多数放射性核素的半衰期都比较短，必须随用随标记，标记后立即使用，不能长期存放（3H与14C除外）。2.各种标记物及其选择目前用于分子杂交的探针标记物已有20多种，可分为放射性和非放射性两大类。2.非放射性标记物生物素（biotin）、地高辛配基（digoxigenin）、荧光素等多数非放射性标记探针的敏感性较差，但稳定性好、分辨力高、检测所需的时间短，尤其是操作过程中不需要放射性防护设备，在安全方面大大优于放射性标记探针。3.探针的标记方法放射性标记分为体内标记法及体外标记法两种，而基因工程中常用体外标记。体外标记法又分为化学法和酶法两种。化学法是通过标记物的活性基团与核酸分子中的某种基团发生化学反应进行标记，标记物直接与核酸分子相连。酶法标记是先将标记物标记在核苷酸上，然后在通过酶促聚合反应使带有标记的核苷酸掺入到核酸序列中，产生标记核酸探针。3.探针的标记方法常用的酶法标记有切口平移法（nicktranslation）和随机引物法（randompriming），这两种方法均为均一标记。此外还有一种是利用多核苷酸激酶的末端标记法，为不均匀标记。1.切口平移法2.随机引物法随机引物法优点：①模板的纯度不需很高即可标记；②反应比较稳定，可通过延长反应时间来增加探针产量；③标记探针的比活较高，可达到4×109cpm/μg；④该法可以在低熔点的琼脂糖中进行。5’-端标记，标记物常用[γ-32P]ATP。T4多聚核苷酸激酶5’-末端标记法3’-末端标记可使用末端转移酶，[α-32P]dNTP加到寡核苷酸的3’-末端，可以加上单个或多个标记物，多个标记物的加入可以提高探针的比活。3’-末端标记法4.非放射性标记探针的检出目前大多数非放射性探针的制备都是采用分子杂交与酶反应结合的策略，杂交信号的检出依赖于酶反应，其中酶直接标记的探针可直接通过酶反应检测。三、核酸杂交种类与方法（1）固相杂交，也称为膜上印迹杂交，包括Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、斑点杂交及狭缝印迹杂交。（2）细胞原位杂交，标记已知序列的核酸，与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，并对其进行检测的方法。（3）液相杂交。1.固相杂交（膜上印迹杂交）膜上印迹杂交是指将待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。这种膜上印迹杂交的技术也称印迹技术。根据核酸分子的种类不同，印迹技术（或方法）分为Southern印迹和Northern印迹。根据核酸转移方式的不同也有不同的印迹方法：①斑点或狭缝印迹法；②虹吸转移印迹方法；③电转移印迹方法；④真空转移印迹方法。印迹杂交实验中，选择有效的转移方法和良好的固相支持物此项技术成败的关键。固相支持物种类很多，一种良好的固相支持物应具备以下几个特点：①具有较强的结合核酸分子的能力；②与核酸分子结合后，应不影响与探针分子的杂交反应；③与核酸分子的结合稳定牢固，能经受杂交、洗膜等操作而不致于脱落或脱落极少；④非特异性吸附少，在洗膜条件下能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱掉；⑤具有良好的机械性能，如柔软性好、韧性强等，以便于操作。（1）固相支持物的选择（1）原理

Southern印迹是由Southern于1975年发明建立，是指将电泳分离的DNA从凝胶中转移到固相支持物上的过程。（2）Southern印迹杂交（2）Southern印迹杂交Northern印迹杂交是细胞总RNA或mRNA与DNA探针的杂交的印迹过程。（1）Northern印迹杂交的原理：提取植物总RNA或mRNA，用变性凝胶电泳分离，不同的RNA分子将按分子量大小依次排布在凝胶上，原位转移至固相膜，在适宜的离子强度及温度条件下，探针与膜上的同源序列杂交形成RNA-DNA杂交双链，通过探针的标记性质可以检出杂交体。根据杂交体在膜上的位置可进一步分析杂交RNA的大小。若经过上述杂交操作膜上没有出现杂交带，说明外源基因虽然已整合到植物染色体上，但在该取材部位及生理状态下并未有效表达。（3）Northern印迹杂交（2）Northern印迹杂交程序基本程序与Southern印迹杂交一样，只是电泳分离有较大差别，Southern印迹杂交是用普通琼脂糖凝胶分离DNA分子，而Northern印迹杂交则是用变性凝胶电泳来分离RNA分子。RNA电泳时必须注意两个问题：①防止单链RNA形成高级结构，所以必须采用变性凝胶；②电泳过程中始终要有效抑制RNA酶的作用。斑点杂交是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。（4）斑点杂交2.菌落原位杂交菌落原位杂交是DNA探针与菌落DNA的杂交，于1975年，由M.Grunsyein和D.Hogness提出。具体做法是把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素滤膜上，使溶菌变性的DNA与滤膜原位结合，因为生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑是按照原来的位置不变地转移到滤膜上，并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，故称为菌落原位杂交。3.组织原位杂交组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落原位杂交不同，菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交，而组织原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，因此组织原位杂交可以确定探针互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。第一节核酸分子杂交技术第二节芯片技术第三节蛋白质组学与酵母双杂交第四节基因敲除技术第五节生物信息学本章内容第三节蛋白质组学与酵母双杂交随着人类基因组计划的逐步完成，科学家们又进一步提出了后基因组计划，蛋白质组研究是其中一个很重要的内容。蛋白质组学主要研究大系统或部分网络组成的多个不同蛋白质的相互作用关系，主要是鉴定系统的行为而不是任何单一组分的行为。根据蛋白质组学的研究内容可以分为：①表达蛋白质组学（expressionproteomics）：即研究细胞、组织中的蛋白，建立蛋白定量表达图谱；②细胞图谱蛋白质组学（cell-mapproteomics）：即确定蛋白质在亚细胞结构中的位置，通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白复合物组成等，来确定蛋白质-蛋白质的相互作用。蛋白质组从整体的蛋白质水平上，更加深入、更加贴近生命本质的层次上去探讨和发现生命活动的规律。二、酵母双杂交技术（一）酵母双杂交的基本原理最早的酵母双杂交系统由Fields和Song等在研究真核基因转录调控中建立。采用转录激活因子单独的DNA结合区不能激活基因转录，但当DNA结合结构域与激活结构域物理性结合时，即能够发挥其转录激活功能。典型的真核生长转录因子如GAIA、GCN4等都含有两个不同的且相对独立的结构域：DNA结合结构域(DNA-bindingdomain，DNA-BD)和转录激活结构域(transcription-activatingdomain,AD)。二、酵母双杂交技术（一）酵母双杂交的基本原理前者可识别位于GAL4效应基因（GALL-responsegene）的上游激活序列（Upstreamactivatingsequence,UAS）并与之结合，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分相互作用，从而启动它所调节的基因的转录。即：DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。（二）酵母双杂交技术的应用酵母双杂交系统是研究蛋白-蛋白相互作用的重要技术手段，已广泛地应用于蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA、蛋白质与RNA以及蛋白与其他小分子间相互作用的研究，在蛋白相互作用图谱，多肽药物和寻找药物靶标，植物与病原物识别及抗病信号传导研究中也发挥了重要作用。“十二五”普通高等教育国家级规划教材1.建立蛋白相互作用图谱有科学家应用10种功能已知的与mRNA前体剪接有关的蛋白质作起始“诱饵”，从含有约5×l06个克隆的酿酒酵母基因组文库中进行多轮筛选，获得约700个阳性克隆，在这些筛选到的靶蛋白中，有9种是已知的mRNA前体剪接因子，5种是新发现的剪接因子，8种是与RNA其他加工过程有关的因子，还有45种与其他的功能有关。此外在以线虫的生殖发育过程为研究对象，利用已知的27个线虫发育相关蛋白建立了一个大规模的双杂交系统，获得了100多个相互作用的蛋白。由此可见，酵母双杂交技术为绘制生物体的蛋白质相互作用的网状图谱提供了条件。“十二五”普通高等教育国家级规划教材2.筛选多肽药物和寻找药物靶标利用双杂交系统可以确定治疗所用的多肽类药物与肿瘤、细菌以及病毒的蛋白质间的相互作用。因此，该技术已逐渐被应用于筛选新型的具有生物活性的肽类药物、诊断试剂和其他功能性多肽。我国学者通过将随机DNA片段与GAIA的AD融合构建酵母表达载体，成功构建了一个可筛选扩增的酵母双杂交随机肽库，用于筛选和设计靶蛋白相互作用的药物多肽。3.在植物与病原物识别中的应用“十二五”普通高等教育国家级规划教材4.在植物抗病信号传导研究中的应用利用酵母双杂交系统在以Pto抗病蛋白为核心的信号传导链中先后鉴定出多种重要的蛋白元件，已初步勾勒出了Pto抗病信号传导途径的线条。应用酵母双杂交系统可以从番茄基因文库中“钓”出了与Pto蛋白互作的蛋白Ptil。Ptil属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，已经被证实是Pto蛋白激酶专一性磷酸化作用的底物。有学者利用酵母双杂交系统研究证实了Pto蛋白功能的发挥与另一个抗病蛋白Prf(具有NBS．LRR结构)密不可分，认为Prf蛋白可能是Pto激酶磷酸化的直接作用底物。“十二五”普通高等教育国家级规划教材二、基因敲除技术的应用基因敲除技术可以选择性地修饰基因及选择如何去修饰，最终完全控制该段基因的DNA序列或修饰其周围的调控元件。由于几乎所有生命现象均由基因控制或受其影响，因此，基因敲除技术在几乎所有生物学领域如微生物学、动物学、植物学、医学等领域都有应用价值。它目前已经广泛的应用于各个方面，并取得了较大的进展。“十二五”普通高等教育国家级规划教材第一节核酸分子杂交技术第二节芯片技术第三节蛋白质组学与酵母双杂交第四节基因敲除技术第五节生物信息学本章内容第四节

基因敲除技术基因敲除（Knockout）又称为基因打靶，是指人为地从DNA分子水平上去除或替换某一个基因，使细胞内的某种特定遗传信息无法再表达，进而从整体水平或细胞水平推测相关基因功能的一种技术。基因敲除技术起源于20世纪80年代，是在基因同源重组技术和胚胎干细胞(EmbryonicStemcell，ES)技术的基础上建立起来的一种新分子生物学技术。基因同源重组技术是指当外源DNA片段大且与宿主基因片段同源性强者并互补结合时，结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换(即重组)的可能，因此这种重组技术又称为同源重组。“十二五”普通高等教育国家级规划教材所谓胚胎干细胞是从着床前胚胎(孕3—5天)分离出的内细胞团(Innercellmass，ICM)细胞，它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能，能在体外培养并保留发育的全能性。在体外进行遗传操作后，将它重新植回小鼠子宫，该细胞能发育成胚胎的各种组织乃至于一个个体。基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一特定位点上，以达到定点修饰改造染色体上某一目的基因的一种技术。它包括如下主要步骤：①构建重组载体；②重组DNA转入受体细胞核内；③筛选目的细胞；④转基因动物。这种方法的出现克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。“十二五”普通高等教育国家级规划教材该项技术的诞生是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景。“十二五”普通高等教育国家级规划教材一、Cre-LoxP基因敲除系统基因敲除的重组载体系统主要有插入性载体系统和替换性载体系统。插入性载体系统构建载体时主要包括：要插入的基因片段(目的基因)、同源序列片段、标志基因片段等成分；替换性载体系统主要包括：同源序列片段、替换基因的启动子和报道基因等成分。Tsien等于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。该技术以Cre/LoxP系统为基础，因为Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就能够发生在哪种组织细胞中。下面就Cre-LoxP基因敲除系统的基本原理做简要介绍。“十二五”普通高等教育国家级规划教材Cre-LoxP系统属于传统的同源重组载体,但是具有了时空调控的功能。它由Cre重组酶和LoxP位点两部分组成。Cre重组酶于1981年从P1噬菌体中发现，属于λInt酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp，编码38kDa蛋白质。是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。LoxP（locusofX-overP1）序列同样来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。“十二五”普通高等教育国家级规划教材Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。当两个loxP序列方向相同并且位于同一条染色体上时，Cre编码的重组酶蛋白能够将相同方向的loxP位点之间的核苷酸序列切除成为游离态，即有效切除两个loxP位点之间的核苷酸序列；当两个LoxP的序列相反时，Cre重组酶使两个loxP序列颠倒，并且这两种反应处于一种平衡状态；当两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上面时，Cre重组酶能够介导两条DNA的交换或促使染色体易位。“十二五”普通高等教育国家级规划教材Cre重组酶能识别34bp的部分回文的loxP序列，介导LoxP的34bp重复序列的位点特异性重组,切除同向重复的2个LoxP位点间的DNA片段和1个LoxP位点，同时保留1个LoxP位点，从而使两个loxP位点之间的序列发生特异性的重组或删除。该特性从而使得Cre-Loxp系统广泛用于条件性基因敲除的研究。“十二五”普通高等教育国家级规划教材图11-4Cre-LoxP介导的基因表达启动或关闭机制“十二五”普通高等教育国家级规划教材Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域，而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。利用这一特点，人们在进行构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列用于基因突变或修复，增加了该系统的应用范围。重组酶介导的盒式交换(recombinasemediatedcas-setteexchange,RMCE)方法就是以8bp的间隔区发生改变为基础构建的，同时结合盒式交换来突现动物的表型而易于鉴别。“十二五”普通高等教育国家级规划教材与传统的重组载体相比较，Cre-LoxP的不同点包括：在被Cre重组酶介导的重组发生前内源基因功能正常，对基因组的任何改造必须位于编码区以外或者内含子区并且不干扰调节区域的功能；根据删除片段的要求改变LoxP位点的插入方式可以得到不同的重组体；每段被改造的DNA片段都含有酶切位点便于用Southern印迹证实；便于区分打靶后不同细胞类型(野生型、打靶但未重组型、重组型)的显像策略。“十二五”普通高等教育国家级规划教材Cre-LoxP系统既可以用在细胞水平上，将Cre重组酶表达质粒转染到靶细胞中，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在整体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，再通过二代遗传就可得到删除外源标记基因的条件性基因敲除子代小鼠。例如，应用该系统删除小鼠X染色体雄激素受体基因产生雄激素受体基因缺失小鼠，就能够阐述雄激素受体的功能是正常雌性动物生产能力所必需的机理，进一步说明雄激素受体是一种治疗卵巢功能早衰的潜在的靶基因。“十二五”普通高等教育国家级规划教材Cre-LoxP系统还可以用于染色体间的基因重排。通过在特异性位点同源重组导入含有LoxP序列的5′Hprt框，然后随机整合含有LoxP序列的3′Hprt框，结果在Cre酶的作用下，两个LoxP位点之间发生重组，形成具有功能的Hprt微小基因，使重组后的ES细胞在选择培养基中存活下来。这种染色体重排为染色体功能图谱的制作提供了一个很好的技术手段。“十二五”普通高等教育国家级规划教材Cre-LoxP系统可以实现对基因的不同发育阶段、不同组织类型中特异性的删除，可以消除由于基因位置改变造成的影响，加强了对基因的控制能力，使研究者可以更方便地有针对性地进行目标阶段的研究工作。Cre-Loxp介导的条件基因打靶动物模型需要以下途径：①用Cre表达载体转染含有Loxp位点的胚胎干细胞；②利用显微注射法将Cre表达载体注入含Loxp位点的受精卵细胞；③基因中表达Cre重组酶的小鼠与基因组中引入loxP序列的小鼠杂交，筛选出双重转基因鼠。“十二五”普通高等教育国家级规划教材1.基因敲除技术在医疗领域的应用基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，基因敲除可用于建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料。使现代生物学及医学研究领域取得了突破性进展。从基因敲除技术出现至今已生产的基因敲除小鼠模型已有很多，如：包括与癌基因和肿瘤抑制基因、免疫相关基因、生长因子与受体基因，这些模型的建立为治疗人类疾病如：肿瘤、动脉粥样硬化和糖尿病和遗传性疾病等提供了极大的帮助。“十二五”普通高等教育国家级规划教材2.基因敲除技术在改造动植物基因中的应用通过基因敲除技术可以鉴定新基因和寻找新的蛋白质功能，为研究基因的功能和生物效应提供模式。3.基因敲除技术在动植物育种中的应用通过基因敲除可以对动植物的基因进行修饰和改造，生产出一些人类需要培育的生物新品种，它将为人类改良家畜、家禽的性状和品质和解决粮食等相关重大问题带来巨大的机遇。“十二五”普通高等教育国家级规划教材本章小结核酸杂交技术是生物芯片技术的核心，通过杂交可鉴定出某个特定片段是否含有某一特定的核苷酸序列，而对片段的最终确定则需进行DNA