利用微卫星标记分析鲤雌核发育群体的遗传结构

利用微卫星标记分析鲤雌核发育群体的遗传结构

人工诱导鱼类雌性发育是一种特殊的有性生殖方法，通过激活遗传失活的精子来激活卵，并通过限制卵的极体或第一次卵裂来发展。人工雌核发育可以加快基因的纯合进程,是一种快速建立纯系的有效方法。并且在品种培育方面,能够加快纯化品系所需要的传代周期,如吴清江等培育的全雌杂交鲤(CyprinuscarpioL.),吴端生等红鲫近交系的建立,刘明华等在高寒鲤的培育,邹曙明等团头鲂(Megalobramaamblycephala)良种雌核发育群体的建立,均通过雌核发育技术取得了很好效果,并缩短了选育时间。因此,开展鱼类人工雌核发育研究,对于快速准确选育个体大、生长快和抗逆性强的优良品种具有重要意义。传统的鱼类雌核发育子代的纯合度的鉴定,都依赖于表型、染色体技术去分析其后代的纯合度。尽管所得雌核发育子代可证明是由雌核发育所获得,但无法证明所获雌核发育子代在基因座位上(特别是与经济性状相关的基因座位)表现为纯合子还是杂合子。微卫星(Microsatellite)作为一种新的分子标记技术,已广泛应用于分子标记连锁图谱的构建、基因定位、群体遗传学研究和品种鉴定等领域,微卫星标记表现为共显性标记,能够鉴别纯合基因型与杂合基因型,为遗传背景调查提供准确及完整的遗传信息。目前应用微卫星标记技术对鱼类雌核发育群体的纯度分析已有较多报道。本研究利用微卫星分子标记,对人工诱导分别获得的抑制第一次有丝分裂和抑制第一次减数分裂的鲤雌核发育群体进行微卫星群体遗传学研究,并通过微卫星座位分析2个雌核发育群体的杂合性,以探讨2种雌核发育技术在鲤育种中的利用价值,为能快速获得的鲤经济品种纯系提供有效的遗传学依据。1材料和方法1.1抑制第一次有丝分裂鲤雌核发育群体的DNA样品,均采自黑龙江水产研究所生物技术实验室。在繁殖季节经人工催产,获得鲤卵子和红鲫精子,参照传统的人工雌核发育的方法。抑制第一次有丝分裂是以经紫外线灭活的红鲫精子与鲤的卵子受精,受精卵于23℃水族箱中进行孵化,用解剖镜观察以确定第一次卵裂时间(一般在30min左右),然后转移到40℃的循环水浴中进行热休克2min,即获得通过抑制第一次卵裂而得到的第一个雌核发育家系。抑制减数分裂是以经紫外线照射过的红鲫精子与鲤卵子受精5min后,转移到0~4℃水中冷休克45min,抑制第二极体排除而获得的第二个雌核发育家系。1.2edtapsh将剪取的约0.1g鳍条加入200μL裂解液(200μg/mL蛋白酶K;0.5%十二烷基肌氨酸钠;500mmol/LEDTA,pH8.0;),55℃消化,中间不时地轻轻摇动,待组织完全消化后取出,用酚、氯仿、异戊醇(体积比为25∶24∶1)混合液抽提3次,加入RNA酶(终浓度为20μg/mL),37℃保温30min,再用等体积的氯仿抽提1次,将基因组DNA进行数次透析,直至透析液OD270<0.05,无水乙醇沉淀,自然干燥后溶解于1/10TE中,4℃保存备用。1.3pcr扩增体系及程序PCR扩增反应总体积为25μL,其中包括DNA模板1μL(30~50ng/μL),10×PCRbuffer18μL(含Mg2+25mmol/L)1μL、dATP、dGTP、dTTP、dCTP各2mmol/L),上下游引物(10μmol/L)各0.5μL,TaqDNA聚合酶(上海生物工程公司)1U,加ddH2O补足体系。扩增反应均在PE9700型PCR(PE公司)上完成。反应程序为:94℃变性3min;94℃30s,50~55℃30s,72℃30s,38个循环;72℃延伸5min。引物序列及具体退火温度情况见表1。1.4基因病毒成像扩增产物用3.0%的琼脂糖凝胶电泳进行分离,EB染色后用SYDR2/2062(美国基因有限公司)成像。DNA分子量Marker为Promega公司的100bpDNALadder。利用Gelpro软件包(3.2版本)分析每个扩增条带的大小,将不同大小的条带作为基因座位的一个等位基因。1.5杂合位点比例的计算根据所得的基因型数据,利用Popgene(Version3.2)软件统计微卫星基因座的等位基因频率(AlleleFrequency,P)、等位基因数(Numberofalleles,A)、有效等位基因数(EffectiveNumbersofAllele,Ne)、观测杂合度(HeterozygosityObserved,Ho)、期望杂合度(HeterozygosityExpected,He)。杂合位点比例,按照Slate&Pemberton(2002)的方法计算:个体杂合度=个体杂合位点数/个体总位点数。基因-着丝点的重组率(Recombinationrate,R)计算:R=(杂合个体数/总个体数)×100%。2结果与分析2.1微卫星标记pcr扩增对雌核发育的2个品系各随机选择15尾抽提基因组DNA,并选取13对具有高多态的微卫星标记进行扩增,扩增片段大小在105~350bp。图1显示,位点MFW14引物(片段大小为105bp、140bp)和位点HLJ071引物(片段大小为215bp、293bp)分别在2个雌核发育家系中扩增的电泳图谱。2.2微卫星基因座的等位基因特征观测杂合度是实际观测到的杂合子在样本中所占的比例,期望杂合度也称基因多样度,有效等位基因数目主要表示等位基因在群体分布的均匀程度。从表2的结果可以看出,所检测的微卫星基因座位有1~3个等位基因,各基因座位等位基因频率由0.056~1.000不等;其中抑制第一次有丝分裂的雌核发育群体的等位基因频率为0.063~1.000,观测杂合度的平均值为0.22,期望杂合度的平均值为0.24,平均有效等位基因数为1.41;抑制减数分裂的雌核发育群体的等位基因频率为0.056~0.889,观测杂合度的平均值为0.37,期望杂合度的平均值为0.47,平均有效等位基因数为1.93。2.3个微卫星位点的杂合度在13个位点中,除了HLJ109、HLJ044、HLJ172、HLJ034、MFW14和MFW26这6个位点在群体上均表现纯合子外,其余7个微卫星位点均呈现不同程度的杂合,其中在位点MFW4上所有个体均表现为杂合子,且观测杂合度大于期望杂合度。2.4杂合度大小对个体杂合度的影响13个位点在该家系的母本中均表现为杂合子。在该家系中,没有发现完全纯合的个体,其中在HLJ030、MFW23两个位点全部以杂合子形式出现,且观测杂合度大于期望杂合度。在所有杂合座位中,观测杂合度最低的是位点MFW14,为0.11。2.5两性核发育子代中出现的基因杂合和重组实验设计在所分析的鲤抑制减数分裂雌核发育群体中,共有3个基因座位(HLJ034、HLJ044和HLJ071)与着丝粒有重组现象,重组率为20.00%,这表明雌核发育子代中出现的基因杂合,是卵母细胞在减数分裂过程中同源染色体之间发生了基因重组。统计结果见表3。3克氏原核的杂合及重组本研究所用的13对微卫星引物在2个雌核发育群体中都扩增目的片段,未出现无效等位基因现象。理论上抑制第一次卵裂而产生的鲤雌核发育群体,个体的基因型应是完全纯合的;而抑制减数分裂而产生的群体,也可以得到纯合度很高的近交系(个体基因纯合率达60%~90%)。在本研究的13个微卫星座位中,抑制第一次卵裂而获得的群体中仅6个座位表现为纯合子,其余7个微卫星座位均呈现不同程度的杂合,其平均杂合度为0.22,其中在MFW4座位上,所有个体均为杂合子;在抑制减数分裂获得的雌核发育子代中,没有发现纯合个体,其中HLJ030、MFW23等2个座位在所有个体上表现为杂合子,其平均杂合度为0.37。由于本实验获得的两个雌核发育群体,都是用灭活的彩鲫精子受精,饲养一年后,在表型上未发现有鲤鲫杂交个体,因此认为所有子代都是经雌核发育而来。至于在雌核发育子代中出现杂合度高的原因可能是:第一,与鲤的多倍性有关,鲤是没有完全二倍化的四倍体,是经多倍化后自然选择演变而来,由于在减数分裂第一次分裂时同源染色体之间高重组和高交换过程,使雌核发育过程中加倍的四分体之一的雌性原核多数本身就是杂合的,再加倍也只能是杂合座位。何毛贤等在对合浦珠母贝3个群体同工酶研究中,三倍体的平均杂合度(0.286)大于二倍体的平均杂合度(0.255),也说明基因杂合度的高低与多倍性有关。第二,纯合致死基因导致纯合个体死亡,使得杂合子比例升高,由于雌核发育后的受精卵孵化率非常低,而经紫外灭活的精子,除杀死精子的DNA外,促进卵子发育的一些精子蛋白也被破坏,会使一些携带纯合致死基因的胚胎在发育过程中逐渐死亡。第三,鲤受精卵发育具有受精卵发育不同步的现象,受精卵的第二极体排除这一时期发生在卵裂之前,对于抑制第一次卵裂的雌核发育来说,受精卵发育不同步导致在卵裂过程中部分卵子处于第二极体排除时期,使抑制第一次卵裂产生的杂合个体远大于抑制第一次减数分裂产生的杂合个体,这也可能是在抑制第一次卵裂产生的雌核发育群体中,子代杂合位点过高的原因。重组是遗传学的基本现象,在减数分裂染色体加倍过程中,同源染色体的同源部分发生联会和交换,造成雌核发育子代出现基因的杂合现象。有关鱼类雌核发育群体基因重组的报道中,重组率的变动范围较大。如王晓清等采用6对大黄鱼微卫星引物对2个大黄鱼雌核发育家系进行微卫星标记分析时,发现在G1代有3个微卫星座位发生重组,重组率为12.5%,G2代有10个座位发生重组,重组率为41.7%;王伟等发现牙鲆异质雌核发育群体的4个微卫星座位发生重组,重组率为93%~100%;朱晓琛等发现牙鲆减数雌核发育二倍体的8个座位发生重组,平均重组率82.2%;Galbusera等发现非洲鲶有2个微卫星座位发生重组,重组率分别为86%和71%;Francescon等发现欧鲈在6个微卫星座位发生重组,重组率为40%~94%;Nagy等发现鲤的9个基因座位的平均重组率为35%;Thorgaard等发现虹鳟9个基因座位的平均重组率为55%;徐成等发现雌核发育牙鲆的Ldh和Cat两个座位发生重组,重组率分别为52.6%和29.8%。本研究在所分析的鲤雌核发育群体中有3个微卫星座位发生重组,平均重组率为20%,较前面提到的其他鱼类的重组率低。究其原因,可能是由于实验中所择位点离着丝粒较近,易受着丝点干扰;也可能与所操作的对象的基因组特性有关,导致本研究估算的重组率偏低。当然,要获得准确的结论还需要进一步的调查和实验的验证。综上所述,用鲤微卫星标记对抑制第一次卵裂而获得的雌核发育子代的基因型进行检测,发现基因位点的纯合率为78%(杂合率为22%),实验所得结果与理论值相差较大。所获得的雌核发育子代只在少数微卫星座位上表现为纯合,而在大部分座位上仍表现为杂合,因此若要直接建立纯系还需要更多的共显性遗传标记对群体的纯