基于代谢组学的黄连治疗型糖尿病的机制研究

基于代谢组学的黄连治疗型糖尿病的机制研究

糖尿病是一种慢性代谢性疾病，主要表现为糖酶，伴有糖、脂肪和蛋白质的代谢障碍。Ⅱ型糖尿病的发生是多源性的,是遗传因素和环境因素共同作用的结果,病因与胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足有关。目前关于糖尿病的治疗有很多种方法,包括合理控制饮食、适量的运动、药物治疗等。其中,降糖的药物主要分为中药和西药,中药虽然降糖速度、降糖效果不及西药,但中药在预防糖尿病合并症的发生、发展方面有一定的优势,所以,关于中药治疗糖尿病的机制日益被关注和重视。代谢组学是继蛋白质组学、基因组学后发展的一种全新的组学技术,它利用高分离效率、高灵敏度的仪器,研究生物体对病理生理刺激或基因修饰产生的代谢物质的质和量的动态变化,揭示生物体的病理生理变化实质和机制。与药理生化指标相比较,代谢组学能够提供更丰富的机体内源性物质的信息,所以,该方法在药物代谢、药物毒性筛选和作用机制研究中有很好的前途。黄连为毛莨科植物黄连(CoptischinensisFranch.)、三角叶黄连(CoptisdletoideaC.ChengetetHsiao)和云南黄连(Coptis.teetaWall)的根,味苦、性寒,入心、肝、胃、大肠经,可清热燥湿,泻火解毒。具有抗炎、抗菌、抗溃疡、增加冠状动脉血流量和降低血压的作用,目前亦被应用于糖尿病的临床治疗,能明显改善糖尿病“三多一少”的症状。小檗碱是黄连的主要活性成分,近年来已被应用于糖尿病的长期临床治疗。前期研究结果表明,小檗碱具有降血糖、提高胰岛素敏感性、调节脂肪代谢紊乱的作用。但是从机体内源性物质的角度分析黄连治疗糖尿病的机理还缺少相关研究。代谢组学的出现为中药从机体分子层次研究治疗疾病的机理提供了可行性的实验方法。本文应用代谢组学的方法,研究黄连对Ⅱ型糖尿病机体中内源性物质的影响,从内源性物质在黄连给药前后的变化趋势来探讨黄连治疗Ⅱ型糖尿病的可能代谢途径,进而为中药治疗糖尿病机制的研究提供实验参考。1实验部分1.1药物、药物和药物日本岛津QP2010气相色谱-质谱联用仪(GC-MS-QP2010),配备电子轰击(EI)离子源,AOC-20i自动进样器,CENCO型涡旋仪(荷兰Breda公司),BiofugeStratos型低温高速离心机(德国Heracus公司),Labconco型冷冻干燥机(美国Labconco公司)。N,O-双三甲硅基三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)、脲酶和吡啶(分析纯,美国Sigma-Aldrich公司),链脲佐菌素(STZ)购自北京博爱港商贸有限公司。二甲双胍购自天津太平洋药业有限公司。黄连药材购自大连阳光药房。羟基乙酸(glycolate)、4-甲基苯酚(4-methylphenol)、苯甲酸(benzoicacid)、1H-吲哚(1H-indole)、2,3-二羟基丁酸(2,3-dihydroxy-butanoicacid)、苹果酸(malicacid)、丁四醇(threitol)、3-羟基己二酸(3-hydroxyhexanedioicacid)、阿拉伯糖醇(arabinitol)、L-抗坏血酸(L-ascorbicacid)、氨基丙二酸(aminomalonicacid)、核糖酸(ribonicacid)标准品和内标物癸酸均购自美国Sigma-Aldrich公司。1.2制备含生药溶液取黄连适量,加相当于药材10倍体积的冷水浸泡0.5h,加热至沸腾,煎煮2h,倾出药液,残渣加入8倍体积的水,煎煮2h后取药液,合并2次药液,过滤,减压浓缩至相当于1mL含生药1g,置于4℃冰箱中备用。1.3大鼠的造模造药雄性Wistar大鼠(160~180g)购自大连医科大学实验动物中心,每日给予大鼠标准食物和饮用水各两次,保持光照和避光循环饲养(12h/12h);实验开始前保持室内饲养1周。1周后,大鼠每日灌胃脂肪乳1mL/100g,连续灌胃20d。脂肪乳的配方是20g猪油、0.5g甲基硫氧嘧啶、5g胆固醇、1g谷氨酸钠、5g蔗糖、5g果糖、20mL吐温-80和10mL甘油混匀,用水定容到100mL。灌胃脂肪乳20d后,大鼠禁食12h,腹腔注射STZ40mg/kg,注射后72h,用UltraTM稳豪型血糖仪(美国强生公司)测大鼠的空腹血糖(FBG),血糖值大于11.0mmol/L的大鼠为糖尿病大鼠,纳入实验。糖尿病大鼠分为模型组、黄连组(给药量10g/kg黄连提取物)和二甲双胍组(给药量0.08g/kg),均采用口服灌胃给药方式,给药30d,同时大鼠每日上午给药(模型组大鼠灌胃等量生理盐水),下午灌胃脂肪乳1mL/100g;正常组每日上下午各一次,均灌胃给予等量的生理盐水。1.4-80坡大鼠给药30d后,从最后一次给药开始,代谢24h,24h后大鼠放入代谢笼中,正常饮食和饮水,收集24h尿液,置于-80℃冰箱中备用。收集24h尿液后,大鼠禁食12h,乙醚浅麻醉后,眼眶采血于肝素钠管,离心后,血浆用于检测胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)(大连医科大学附属第一医院检验科检验),同时剪尾采血测FBG,然后灌胃葡萄糖溶液2g/kg,做口服糖耐量试验,分别测灌胃后30、60、120min时的血糖值(BG)。1.5去尿器h的去尿工艺尿样于室温下解冻后于5000r/min离心5min,移取上清液100μL于1.5mL离心管中,加入50μL脲酶水溶液(60IU/100μL),混合均匀后于37℃水浴孵育0.5h以去除尿液中含有的尿素。孵育结束后加入20μL内标(0.088g/L癸酸溶液)及400μL甲醇,涡旋1min混匀,于12000r/min4℃离心15min,吸取上清液400μL于进样瓶中,加入50μL衍生化试剂(V(BSTFA)∶V(TMCS)=99∶1)和50μL吡啶,于80℃水浴反应0.5h,离心,上清液用于GC-MS分析。质控(QC)尿样的制备:所有尿样于室温下解冻,每个尿样吸取50μL于同一5mL离心管中,涡旋1min混合均匀,按照上述尿样制备方法制备QC尿样,用于GC-MS分析。在分析序列中,每8个样本加入一个QC样本。1.6流速和流比HP-5色谱柱:30m×0.32mm×0.25μm(AgilentJ﹠W);进样口温度:280℃;分流比:10∶1;载气He;流速:1.88mL/min;柱温程序:起始温度60℃,保持3min后,以4℃/min的速度升温,升温到270℃,在270℃保持10min。进样量:1.0μL。离子源和接口温度分别为200℃和300℃;电子能量:70eV;溶剂延迟:5.5min;全扫描模式,扫描范围m/z40~600。1.7分析峰表及主成分分析药理数据采用SPSS13.0软件中one-wayANOVA进行分析,所有数据用均数±标准差(mean±SD)表示,两两比较用t检验方法,结果以p<0.05表示有显著性差异。尿样原始数据采用GC-MS工作软件积分,积分后导出数据,经自编软件进行峰匹配,设定峰匹配时间半径为0.05min,峰宽为0.5min,峰匹配后得到原始峰表。在原始峰表中去除QC样本测定相对标准偏差(RSD)大于15%的变量及空白实验中存在的变量,获得最终的分析峰表。主成分分析(PCA)采用SIMCA-P软件(version11.0,UmetricsAB,Sweden)进行。t检验同样采用SPSS13.0软件。2结果与讨论2.1对大鼠模型的影响大鼠治疗前后空腹血糖值的结果见表1,在大鼠给药前,模型组、黄连组、二甲双胍组的空腹血糖值与正常组比较显著性上升(三者没有显著性差异),均为Ⅱ型糖尿病模型大鼠(FBG>11.0mmol/L)。模型组大鼠的空腹血糖值在大鼠给药前后(生理盐水30d)没有显著性差异,说明该造模方法获得的Ⅱ型糖尿病模型是稳定的。糖尿病大鼠给药黄连30d后,大鼠的空腹血糖值与模型组相比降低了59.26%。黄连给药后,大鼠的空腹血糖值与给药前相比较降低了53.42%。二甲双胍给药后,大鼠的空腹血糖值与给药前相比较降低了41.65%。结果说明黄连、二甲双胍均有降低血糖的作用。对各组糖尿病大鼠口服糖耐量试验的结果见图1,大鼠灌胃葡萄糖溶液30,60min后,与模型组比较,各给药组的血糖值有降低的趋势,但无显著性改变。大鼠灌胃葡萄糖溶液120min后,与模型组比较,黄连组、二甲双胍组的血糖值显著性降低。黄连组、二甲双胍组血糖曲线下面积(AUC)与模型组比较,二者相互间无显著性差异。说明黄连、二甲双胍在一定程度上能增强胰岛素敏感性,提高对血糖的调节能力。2.2对大鼠的影响各组的生化指标检测结果见表1,与正常组相比,模型组的TC、TG明显升高,说明大鼠注射STZ并长期灌胃脂肪乳造成Ⅱ型糖尿病模型后,血糖、血脂升高,造成糖、脂肪代谢紊乱。与模型组相比,大鼠给药黄连后,TC、TG分别下降了58.66%,42.18%。经阳性对照药二甲双胍给药后,TC、TG分别下降了57.29%,54.36%,说明黄连、二甲双胍均有调节血脂的作用。2.3正常组和模型组离子分离程度分析大鼠尿样采用GC-MS联用技术分析,尿样的典型总离子流图如图2。通过峰检测、匹配,并进行变量筛选,最终生成变量数为147个的数据矩阵用于模式识别,该变量为离子碎片,信息包含离子的保留时间、质荷比和绝对离子峰强度。对上述数据矩阵进行PCA分析,结果见图3,第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)包含的信息量分别为21.3%和12.3%。由图3可知,正常组与模型组获得明显的区分。二甲双胍组除有2个样本与模型组未分开,大部分样本与模型组有分离的趋势。黄连组位于模型组与正常组之间,更接近于正常组。说明正常组与模型组的尿液内源性代谢指纹存在显著的差异,黄连与二甲双胍的治疗对内源性代谢产物的调节作用存在显著的差异。2.4糖尿病大鼠单次给药后差异开导性物理论依据的变化为确定与糖尿病相关的差异代谢物,采用SPSS13.0软件对正常组与模型组的尿液代谢物进行one-wayANOVA分析,如果p﹤0.05,该代谢物确定为与糖尿病相关的差异代谢物。代谢物通过GC-MS软件所附的NIST02谱库进行谱图检索定性,部分代谢物采用标准对照品进行确证,共发现和鉴定了12个差异代谢物,结果见图4。与正常组比较,模型组中的羟基乙酸、2,3-二羟基丁酸、苹果酸、丁四醇、3-羟基己二酸、阿拉伯糖醇、L-抗坏血酸显著下降,4-甲基苯酚、苯甲酸、氨基丙二酸、1H-吲哚、核糖酸显著上升。采用SPSS13.0软件分别对黄连、二甲双胍给药组与模型组的尿液代谢物进行one-wayANOVA分析,结果见图4。统计分析结果表明,糖尿病大鼠给药黄连后有7个差异代谢物发现有显著性向正常组调节的趋势。与模型组比较,黄连组的苯甲酸、氨基丙二酸、丁四醇、核糖酸的相对含量显著下降;2,3-二羟基丁酸、L-抗坏血酸、3-羟基己二酸的相对含量显著上升。糖尿病大鼠给药二甲双胍后,发现3个差异代谢物有向正常组显著性调节的趋势。与模型组比较,二甲双胍组的4-甲基苯酚、1H-吲哚、阿拉伯糖醇的相对含量显著下降。2.5治疗糖尿病合并症的代谢组学研究Ⅱ型糖尿病是一种慢性代谢性疾病,主要表现为胰岛素抵抗的葡萄糖代谢紊乱,同时伴有脂肪代谢紊乱。Ⅱ型糖尿病的动物造模方法目前有很多种,包括遗传性糖尿病大鼠模型、四氧嘧啶造模方法、链脲佐菌素造模方法、高脂饲料伴小剂量链脲佐菌素造模方法等。本研究考虑Ⅱ型糖尿病的造模方法要接近于人的致病原因,以及大鼠成模率要高、模型稳定等因素,最后确定采用高脂饲料伴小剂量链脲佐菌素造模方法。生化指标检测结果表明,模型组的血糖、血脂在造模后30d内无显著性差异,一直为高血糖、高血脂的模型,说明该造模方法稳定、可靠。糖尿病大鼠分别给药黄连、二甲双胍治疗后,其血糖、血脂均显著降低,实验结果表明,黄连、二甲双胍均具有降血糖、降血脂的作用。对糖尿病大鼠尿样中内源性物质分析后,发现有12个代谢物与糖尿病相关。其中4-甲基苯酚、苯甲酸、1H-吲哚这些差异代谢物与肠道菌群代谢紊乱相关;有研究表明,糖尿病与肠道菌群代谢紊乱相关,4-甲基苯酚、1H-吲哚是食物中蛋白质在肠道菌群作用下的代谢产物,苯甲酸是含有苯基脂肪的ω-氧化分解的产物。本研究发现,糖尿病模型大鼠体内4-甲基苯酚、苯甲酸、1H-吲哚相对含量显著性升高,分别给药黄连、二甲双胍治疗后,这些代谢物出现向正常组显著调节的趋势,表明黄连对肠道菌群代谢紊乱可能有调节作用,进而在一定程度上发挥对高血糖的调节作用。本研究发现与糖尿病相关的代谢物中,氨基丙二酸、L-抗坏血酸亦是反映机体氧化应激状态的代谢物,其中氨基丙二酸是甘氨酸氧化的一种代谢物。糖尿病患者的机体多伴有氧化应激状态,持续的高血糖导致内皮细胞线粒体生成的超氧负离子增多,蛋白质糖基化作用增强等,使机体处于氧化应激状态,过多的氧自由基损伤组织,增加糖尿病合并症发生的几率。黄连给药后,氨基丙二酸、L-抗坏血酸均出现向正常组显著调节的趋势,这些数据表明,黄连在降低血糖的同时,对机体的氧化应激状态亦有调节作用。氧化应激状态能增加糖尿病患者合并症的发生、发展,黄连对机体内与氧化应激状态有关的代谢物的调节作用,表明黄连可能在一定程度上能够预防糖尿病合并症的发生、发展。2,3-二羟基丁酸是苏氨酸的代谢产物之一,苏氨酸是人体必需氨基酸、是一种升糖氨基酸。关