代谢组学在生物体系中的应用

代谢组学在生物体系中的应用

代谢组学是经过基因组学、转换组学和蛋白质组学之后发展起来的系统生物学的一个新分支。这是在生物系统受刺激或中断前后（例如，在特定基因变异或环境变化后）研究生物系统的代谢产物光谱及其动态变化的技术。研究的主题主要是相对于。子质量1000以下的内源性小分子。与转录组学和蛋白质组学等其他组学相比,代谢组学具有以下优点:(1)基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物水平得到放大;(2)代谢组学的研究不需进行全基因组测序或建立大量表达序列标签的数据库;(3)代谢物的种类远少于基因和蛋白的数目;(4)生物体液的代谢物分析可反映机体系统的生理和病理状态。通过代谢组学研究既可以发现生物体在受到各种内外环境扰动后的应答不同,也可以区分同种不同个体之间的表型差异。代谢组学相关研究可追溯到始于上世纪70年代的代谢谱分析(metabolicprofiling),这类代谢谱分析通常采用气相色谱质谱联用技术(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)对患者体液中代谢物进行定性、定量分析及对疾病进行筛选和诊断。这种在临床上利用代谢谱分析诊断有关疾病的方法一直延用至今。1983年,荷兰应用科学研究组织vanderGreef在国际上首先采用质谱对尿中代谢指纹进行研究,并陆续有不少科学家开始应用高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography,HPLC)和核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)技术进行代谢谱分析。90年代后,研究目标主要集中在药物在体内的代谢等方面。1997年,Oliver提出了通过定量分析尽可能多的代谢产物评估酵母基因的遗传功能及其冗余度的必要性,首次将代谢产物和生物基因的功能联系起来。1999年,Nicholson等提出metabonomics的概念,将代谢组学定义为生物体对病理生理或基因修饰等刺激产生的代谢物质动态应答的定量测定。2000年,德国马普所的Fiehn等提出了metabolomics的概念,将其定义为对限定条件下的特定生物样品中所有代谢产物的定性定量分析。在21世纪的前几年,植物和微生物领域应用色谱-质谱技术进行细胞的代谢组学研究,用metabolomics的较多;而在药物研发和疾病研究等领域,用NMR以动物体液或组织样品为研究对象的,则用metabonomics较多。随着研究的深入,现在对这两个名词的区分已越来越少,基本等同使用。其它高通量代谢产物的提取和分析代谢组学研究一般包括代谢组数据的采集、数据预处理、多变量数据分析、标记物识别和途径分析等步骤。生物样品(如尿液、血液、组织、细胞和培养液等)采集后进行生物反应灭活、预处理。运用核磁共振、质谱或色谱等检测其中代谢物的种类、含量、状态及其变化,得到代谢谱或代谢指纹,而后使用多变量数据分析方法对获得的多维复杂数据进行降维和信息挖掘,并研究相关代谢物变化涉及的代谢途径和变化规律,以阐述生物体对相应刺激的响应机制、发现生物标记物。样品采集与制备样品的采集与制备是代谢组学研究的初始步骤也是最重要的步骤之一,代谢组学研究要求严格的实验设计和合适的分析精度。首先需要采集足够数量的样本,从而可有效减少源于生物样品个体差异对分析结果的影响,得到有统计学意义的分析数据。实验设计中对样品收集的时间、部位、种类、样本群体等应给予充分考虑。在研究人类样本时,还需考虑饮食、性别、年龄和地域等诸多因素的影响。此外,分析过程要有严格的质量控制,需要考察如样本的重复性、分析精度、空白等。代谢产物的变化对分析结果有较大的影响,在处理生物样本时要特别注意避免由于残留酶活性或氧化还原过程降解代谢产物、产生新的代谢产物。通常需对所收集样品进行快速淬灭(quenching)。灭活的方法很多,如液氮冷冻、酸处理等。在代谢组学研究中,根据研究对象、目的和采用的分析技术不同,所需的样品提取和预处理方法各异。如采用NMR的技术平台,只需对样品做较少的预处理即可以分析;采用MS进行“全”成分分析技术时,样品处理方法相对简单,但不存在一种普适性的标准化方法。代谢产物通常用水或有机溶剂(如甲醇、己烷等)分别提取,获得水提取物和有机溶剂提取物,从而把非极性相和极性相分开,以便进行分析。对于代谢轮廓谱或靶标分析,还需要做较为复杂地处理,如常用固相微萃取、固相萃取、亲和色谱等预处理方法。用气相色谱或气相色谱-质谱联用时,常常需要进行衍生化,增加样品的挥发性。由于特定的提取条件往往仅适合某些类化合物,目前尚无一种能够适合所有代谢产物的提取方法。应该根据不同的化合物选择不同的提取方法,并对提取条件进行优化。代谢组学研究在整个样品处理和分析过程中,应尽可能保留和体现样品中代谢物的信息,生物样品的收集、灭活、储存、处理、仪器分析和数据处理等环节的标准化问题已越来越引起研究者的重视。数据采集完成样本的采集和预处理后,样品中的代谢产物需通过合适的方法进行测定。代谢组学分析方法要求具有高灵敏度、高通量和无偏向性的特点,与原有的各种组学技术只分析特定类型的化合物不同,代谢组学所分析的对象的大小、数量、官能团、挥发性、带电性、电迁移率、极性以及其他物理化学参数差异很大。由于代谢产物和生物体系的复杂性,至今为止,尚无一种能满足上述所有要求的代谢组学分析技术,现有的分析技术都有各自的优势和适用范围。最好采用联用技术和多种方法综合分析。色谱、质谱、NMR、毛细管电泳、红外光谱、电化学检测等分离分析手段及其组合都出现在代谢组学的研究中。其中色谱-质谱联用方法兼备色谱的高分离度、高通量及质谱的普适性、高灵敏度和特异性,NMR特别是1H-NMR以其对含氢代谢产物的普适性而成为最主要的分析工具。NMR:NMR是当前代谢组学研究中的主要技术,NMR的优势在于能够对样品实现无创性、无偏向的检测,具有良好的客观性和重现性,样品不需要繁琐处理,具有较高的通量和较低的单位样品检测成本。此外,1H-NMR对含氢化合物均有响应,能完成样品中大多数化合物的检测,满足代谢组学中的对尽可能多的化合物进行检测的目标。NMR虽然可对复杂样品如尿液、血液等进行非破坏性分析,与质谱法相比,它的缺点是检测灵敏度相对较低(采用现有成熟的超低温探头技术,其检测灵敏度在纳克级水平)、动态范围有限,很难同时测定生物体系中共存的浓度相差较大的代谢产物;同时,购置仪器所需的投资也较大。为了提高NMR技术的灵敏度,研究者们采用了增加场强、使用低温探头和微探头的方法。针对分辨率的问题,使用了多维核磁共振技术和液相色谱-核磁共振联用(liquidchromatography-nuclearmagneticresonance,LC-NMR)。Daykin等采用色谱技术,利用LC-NMR联用对心血管疾病患者血中的脂蛋白代谢产物进行了检测。Nicholson研究小组采用近年新发展的魔角旋转(magicanglespinning,MAS)技术,让样品与磁场方向成54.17°旋转,从而克服了由于偶极耦合(dipolarcoupling)引起的线展宽、化学位移的各向异性。应用MAS技术,研究者能够获得高质量的NMR谱图,样品中仅加入少量的D2O而不必进行预处理,样品量只需约10mg。基于NMR技术的代谢组学方法已广泛地应用于药物毒性、基因功能以及疾病的临床诊断。质谱:相对于NMR灵敏度低、检测动态范围窄等弱点,MS具有较高的灵敏度和专属性,可以实现对多个化合物的同时快速分析与鉴定。随着质谱及其联用技术的发展,越来越多的研究者将色谱-质谱联用技术用于代谢组学的研究。GC-MS方法的主要优点包括较高的分辨率和检测灵敏度,并且有可供参考、比较的标准谱图库,可以用于代谢产物定性。但是GC不能直接得到体系中难挥发的大多数代谢组分的信息,对于挥发性较低的代谢产物需要衍生化处理,预处理过程繁琐。GC-MS常用于植物和微生物代谢指纹分析,如Fiehn等采用GC/MS研究拟南芥(arabidopsis)的基因型及其表型的关系,Styczynski等对大肠杆菌的代谢产物进行了详细的分析。LC-MS避免了GC-MS中繁杂的样品前处理,由于其较高的灵敏度和较宽的动态范围,已被越来越多地用于代谢组学研究,它非常适合于生物样本中复杂代谢产物的检测和潜在标记物的鉴定。LC-MS的代谢组学研究通常采用反相填料、梯度洗脱程序,但对于体液样品特别是尿样,含有大量的亲水性代谢产物,这些代谢产物在反相色谱上不保留或保留很弱。最近研究者们使用亲水反应色谱(hydrophilicinteractionchromatography,HILIC)解决亲水性物质的弱保留问题。新的分析技术如超高效液相色谱/高分辨飞行时间质谱技术、毛细管液相色谱-质谱联用技术、傅里叶变换离子回旋共振技术等也被用于代谢组学研究以提高代谢产物的检测灵敏度和通量。我中心研究了一个柱切换二维液相系统,采用2根液相色谱柱(反相色谱柱和亲水作用色谱柱),通过阀切换实现了一次进样亲水和疏水代谢产物的同时检测,解决了复杂生物样品中亲水和疏水性代谢产物的同时检测问题。数据预处理方法:由上述分析仪器导出的元数据(metadata),不能直接用于模式识别分析,还需对数据进行预处理,将元数据转变为适合于多变量分析(主要是模式识别)的数据形式。主要的数据预处理包括滤噪、重叠峰解析(deconvolution)、峰对齐、峰匹配、标准化和归一化等。在实际操作中,并不是这些步骤都需要进行,而是根据实际情况,只做几种预处理。最后用于模式识别的数据为二维矩阵数据形式,行代表样品或实验数目,列表示相应的单个测定指标(通常为代谢物的信号强度等)。广泛应用的滤噪技术是正交信号校正技术(orthogonalsignalcorrection,OSC)。与普通的谱图滤噪技术不同,OSC滤掉与类别判断正交(不相关)的变量信息,只保留与类别判断有关的变量,从而使类别判别分析能集中在这些与类别的判别相关的变量上,提高判别的准确性。OSC等效于从数据中去除了额外的影响因素,因此该方法经常用于易受环境因素影响的分析,例如在微量药物引发的生化效应中,分析结果经常被研究对象的性别、饮食和其他环境因素所淹没,在这种情形下,应用OSC能收到较好的效果。基于色谱-质谱联用技术的代谢组学方法,如流动相组成的微小变化,梯度的重现性及柱温的微小变化及其柱表面的状态变化常导致保留时间的差异。为了利用色谱图中所有可以识别的峰信息,需对谱图实行峰匹配(或称峰对齐),使相同的代谢产物在生成的数据矩阵中由同一个变量表示,使各样本的数据得到正确的比较。在过去的几十年,研究者们已经研究出了很多算法用以这个目的。具有代表性的工作如Nielsen等研究的相关优化曲面算法。最近Jonsson等研究了一种基于GC-MS的代谢组学的策略。由于保留时间的重复性问题,HPLC中的峰匹配要相对困难,我中心研究了可用于代谢轮廓分析和代谢组学研究的液相色谱的“多区域可变保留值窗口”的峰对齐算法,解决了基于色谱技术的代谢轮廓分析方法中的关键技术问题。化学计量学方法代谢组学得到的是大量的、多维的信息。为了充分挖掘所获得数据中的潜在信息,对数据的分析需要应用一系列的化学计量学方法。在代谢组学研究中,大多数是从检测到的代谢产物信息中进行两类(如基因突变前后的响应)或多类(如不同表型间代谢产物)的判别分类,以及生物标记物的发现。数据分析过程中应用的主要手段为模式识别技术,包括非监督(unsupervised)学习方法和有监督(supervised)学习方法。非监督学习方法用于从原始谱图信息或预处理后的信息中对样本进行归类,并采用相应的可视化技术直观地表达出来,不需要有关样品分类的任何背景信息。该方法将得到的分类信息和这些样本的原始信息(如药物的作用位点或疾病的种类等)进行比较,建立代谢产物与这些原始信息的联系,筛选与原始信息相关的标记物,进而考察其中的代谢途径。用于这个目的的方法无可供学习利用的训练样本,所以称为非监督(unsupervised)学习方法。主要有主成分分析(principalcomponentsanalysis,PCA)、非线性映射、簇类分析等。有监督学习方法用于建立类别间的数学模型,使各类样品间达到最大的分离,并利用建立的多参数模型对未知的样本进行预测。在这类方法中,由于建立模型时有可供学习利用的训练样本,所以称为有监督学习。这种方法经常需要建立用来确认样品归类(防止过拟合)的确认集(validationset)和用来测试模型性能的测试集(testset)。应用于该领域的主要是基于PCA、偏最小二乘法(partialleastsquares,PLS)、神经网络的改进方法,常用的有类模拟软独立建模和偏最小二乘法-判别分析(PLS-discriminantanalysis,PLS-DA)。作为非线性的模式识别方法,人工神经元网络(artificialneuronalnetwork,ANN)技术也得到广泛应用。PCA和PLS-DA是代谢组学研究中最常用的模式识别方法,这两种方法通常以得分图(scoreplot)获得对样品分类的信息,载荷图(loadingplot)获得对分类有贡献变量及其贡献大小,从而用于发现可作为生物标记物的变量。此外,在数据处理和分析的各阶段,对数据的质量控制和模型的有效性验证也需引起足够的重视。代谢组学数据库t-q-ms分析药物研发药物研发领域,尤其是西方的药物研发主要沿用靶向研发策略,致使90%的药物仅对30%~50%的患者有效,即50%~70%的患者不但未从所接受的药物治疗中受益,反而要承担其所带来的副作用。代谢组学在疾病动物模型(包括转基因动物)的确证、药物筛选、药效及毒性评价、作用机制和临床评价等方面有着广泛的应用。Nicholson研究小组利用基于NMR代谢组学技术,在药物毒性评价方面开展了深入的工作,其研究表明采用代谢组学方法可判断毒性影响的组织器官及其位点,推测药物相关作用机制,确定与毒性相关的潜在生物标记物;并在此基础上可建立供毒性预测的专家系统以及毒物影响动物内源性代谢物随时间的变化轨迹。英国(伦敦)帝国理工学院与6家制药公司联合组成的小组(theconsortiumformetabonomictoxicology,COMET)开展的药物毒性代谢组学研究项目,基于1H-NMR和模式识别技术,在前3年利用大鼠和小鼠体液、组织的NMR图谱,对147种典型药物的肝肾毒性进行了研究。通过检测正常和受毒动物体液和组织中代谢物的NMR谱,结合已知毒性物质的病理效应建立了第1个大鼠肝脏和肾脏毒性的专家系统。该专家系统分为3个独立的级别可实现正常/异常的判别、对未知标本进行毒性或疾病的识别以及病理学的生物标记物识别。COMET计划的第2期工作于2005年底正式启动,目标是研究标准毒素的分子机制,进而建立可预测性的构效关系。Mally等对1HNMR代谢组学方法用于肾功能损伤标记物的可行性进行了研究。他们采用FeNTA或溴化钾引起的两种肾功能损伤小鼠模型,研究了4-羟基-2(E)-壬醛基-巯基尿酸作为肾功能损伤标记物的可行性,结果表明1HNMR代谢组学方法可以用来指示肾功能损伤,但对氧化应激无特异性;HNE-MA和其他的磷脂过氧化标记物有很好的相关性,标记物的类型与病理条件有关,尚未发现普适性的氧化应激标记物。疾病研究代谢组学在疾病研究中的应用主要包括病变标记物的发现、疾病的诊断、治疗和预后的判断。代谢组学最广泛的应用是发现与疾病诊断、治疗相关的代谢标记物,通过代谢物谱分析得到的相关标志物是疾病的分型、诊断、治疗的基础。目前已有较多文献报道了代谢组学在疾病研究的应用,如新生儿代谢紊乱、冠心病、膀胱炎、高血压和精神系统疾病等。本课题组将所建立的代谢组学方法应用于重大疾病(如肿瘤、2型糖尿病、重型肝炎等)的病变标记物研究中,建立了基于正相液相色谱/电喷雾线性离子阱质谱方法,用于体液中磷脂的代谢轮廓谱分析。将该方法应用于2型糖尿病和健康人进行分类研究,识别出4种可能的磷脂分子生物标记物;研究了n-3型多烯脂肪酸二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenicAcid,DHA)对人类JurkatE-6-1T细胞中膜脂筏和可溶膜区域中几种主要磷脂组成的影响。结果表明,EPA或DHA能够使脂酰链为n-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids,PUFAs)的磷脂含量显著增加,揭示了PUFAs免疫抑制作用的分子机制[15,37,40,51,60,82,83,84,85,86]。本课题组还建立了基于固相萃取(solidphaseextraction,SPE)-HPLC的体液中核苷代谢轮廓分析方法,并将该方法应用于肿瘤的研究中,建立了正常人和癌症患者尿中核苷的排放水平和模式;比较了不同癌种之间排放水平的差异,检测癌症的敏感性均显著高于目前已临床应用的肿瘤标记物。同时在区分良恶性肿瘤、监测手术和化疗效果以及预测肿瘤复发等方面都有较好的价值。同时将基于LC-MS方法的代谢组学平台应用于肝病的研究中,实现了不同肝病患者与正常人进行有效区分,肝癌诊断中肝炎和肝硬化患者的假阳性率仅为7.4%。应用于慢性乙型肝炎的急性发作样本,诊断正确率为100%;并鉴定出1个传统标记物和4个新的标记物。植物代谢组学植物代谢组学研究大多集中在代谢轮廓(metabolicprofiling)或代谢物指纹图谱(metabolitefingerprinting)上。根据对象的不同,植物代谢组学的研究主要包括:(1)某些特定种类(species)植物的代谢物组学研究。这类研究通常以某一植物为对象,选择某个器官或组织,对其中的代谢物进行定性和定量分析;(2)不同基因型(genotypes)植物的代谢物组学表型研究。一般需要两个或两个以上的同种植物(包括正常对照和基因修饰植物),然后应用代谢物组学对所研究的不同基因型的植物进行比较和鉴别;(3)某些生态型(ecotypes)植物的代谢物组学。这类研究通常选择不同生态环境下的同种植物,研究生长环境对植物代谢物产生的影响;(4)受外界刺激后植物自身免疫应答。植物代谢组学研究最具代表性的是Fiehn等的工作,他们用GC-MS对4种不同基因型的拟南芥中的433种代谢产物进行分析,结合化学计量学方法对4种不同基因型的植物进行分类,并找到了对其表型分类起重要作用的代谢产物。我中心与中国科学院北京植物所合作,开展了青蒿中萜类物质的代谢途径的研究。建立了基于全二维气相色谱-飞行时间质谱联用技术(comprehensivetwodimensionalgaschromatography-timeofflightmassspectrometry,GC×GC-TOFMS)的青蒿挥发油分离分析方法,对青蒿中挥发油的成分进行分析,结果表明挥发油主要由烷烃、单萜、单萜含氧衍生物、倍半萜、倍半萜含氧衍生物5部分组成。用全二维气相色谱与飞行时间质谱联用技术可从青蒿挥发油中鉴定出300多个化合物,并鉴定出了青蒿素代谢途径中的重要中间产物。采用GC×GC-TOFMS方法对转不同基因青蒿样品进行分析与定性,初步鉴定了将近100种萜类物质并找出普通植株与转基因植株在代谢产物上的差异。利用气相色谱-色谱火焰离子化检测器(gaschromatography-flameionizationdetector,GC-FID)和GC/MS方法为主要手段,对不同生长阶段的青蒿代谢指纹谱进行了研究,青蒿的5个生长时期(幼苗期、成苗期、现蕾前期、现蕾期和盛花期)可以得到很好的区分,并证实了青蒿素产生途径中瓶颈的存在。微生物代谢组学第1篇微生物代谢组学文献报道了基于GC-MS技术,通过分析脂肪酸、氨基酸和糖类并结合化学计量学方法监测肠系膜明串珠菌发酵生产葡聚糖过程中的微生物污染。目前,代谢组学技术已应用于微生物表型分类、突变体筛选、代谢途径及微生物代谢工程、发酵工艺的监控和优化及微生物降解环境污染物等方面。Gao等研究了不同基因修饰下胞内和胞外代谢物的变化规律与特点,并比较了不同底物、不同菌株胞内代谢物指纹谱的差异;考察了环境对微生物代谢的影响,得到不同条件下嗜碱乳酸菌胞内氨基酸变化与发酵液中乳酸产量的关系;研究铜绿假单胞菌和大肠埃希菌在不同抗生素作用下三羧酸(tr