【课件】DNA片段扩增及电泳鉴定++课件高二下学期生物人教版选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序DNA片段的扩增及电泳鉴定PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一种高效的核酸体外扩增技术。PCR技术在生物学实验中具有非常广泛的用途，不仅应用在基因工程的基本操作程序中，还应用在遗传病的诊断、刑侦破案、新型冠状病毒核酸检测等多个领域。一、DNA片段的扩增——PCR（一）实验原理2.PCR还利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。1.

PCR扩增DNA片段的原理：DNA半保留复制。（二）材料用具1.PCR仪：自动控温的仪器，实现DNA的扩增。一、DNA片段的扩增——PCR2.微量离心管：进行PCR反应的场所。总容量为0.2mL（左）和0.5mL(右）的微量离心管PCR仪器（二）材料用具3.微量移液器：用于量取转移PCR配方中的液体。一、DNA片段的扩增——PCR4.一次性吸液枪头：微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头。一次性枪头（二）材料用具一、DNA片段的扩增——PCR5.

PCR反应体系：模拟体内DNA半保留复制PCR反应体系：1.DNA模板；2.原料：4种脱氧核苷酸；3.引物：2种；4.DNA聚合酶；5.合适的反应条件：pH、Mg2+等。下列关于PCR的说法，错误的是（

）A.PCR是体外复制DNA的技术B.PCR过程中只需要一个模板DNA、两种引物分子、大量脱氧核苷酸原料C.TaqDNA聚合酶要具有耐高温的特点D.PCR利用了DNA的热变性原理B用微量移液器把PCR配方中各组分加入到微量离心管中。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。设置好PCR仪循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中。循环程序变性复性延伸预变性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min加样离心扩增（三）方法步骤预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。一、DNA片段的扩增——PCR（三）方法步骤一、DNA片段的扩增——PCR原理：材料用具：基本操作步骤：PCR小结琼脂糖凝胶电泳产物鉴定DNA半保留复制、DNA热变性。PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性枪头、PCR反应体系配方。加样→离心→扩增。（一）实验原理二、PCR产物的鉴定——电泳1.电泳是指在电场作用下，带电分子向着与它所带电荷相反的电极移动的现象。

2.DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。相同长度的DNA双链具有等量的净电荷，因此，同样大小的DNA在电场中会以相同的速率向一极移动。（一）实验原理二、PCR产物的鉴定——电泳PCR产物——DNA的鉴定一般用琼脂糖凝胶电泳。

在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。4.凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。二、PCR产物的鉴定——电泳同一块凝胶中，DNA分子量大小与迁移速率的关系是怎样的？同一块凝胶中，DNA分子越大，迁移速率越慢，反之越快。结束电泳时，DNA分子越大，迁移距离越短，离点样孔越近。下列有关电泳的叙述，不正确的是（

）

A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

B．待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA的迁移速率

C．进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动

D．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定C1.电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）（二）材料用具二、PCR产物的鉴定——电泳梳子制胶槽制胶板制胶工具（二）材料用具二、PCR产物的鉴定——电泳2.电泳缓冲液：主要作用是维持合适的pH，以及使溶液具有一定的导电性以利于DNA的迁移。目前常用的有1×TAE和0.5×TBE缓冲液。内含指示剂，PCR产物与其混合后再进行加样。凝胶载样缓冲液：琼脂糖核酸染料用电泳缓冲液配制质量分数为0.8%—1.2%的琼脂糖溶液，加热至琼脂糖熔化，稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子。凝胶溶液完全凝固后拔出梳子，形成加样孔。取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中。将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。配制琼脂糖溶液制备凝胶加样电泳、观察接通电源，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。（三）方法步骤二、PCR产物的鉴定——电泳原理：材料用具：基本操作步骤：PCR小结原理：材料用具：基本操作步骤：琼脂糖凝胶电泳产物鉴定DNA半保留复制、DNA热变性。PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性枪头、PCR反应体系配方。移液→离心→扩增。电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖、核酸染料。配制琼脂糖溶液→制备凝胶→加样→电泳→观察。电泳原理、影响凝胶中DNA分子迁移速率因素、染色检测。1、判断是否成功扩增出DNA片段的依据是什么？（1）观察DNA条带的分布。如对比标准参照物（Maker），可知扩增出的DNA片段大小。（2）观察DNA条带的粗细程度。结果分析与评价如果电泳鉴定结果没有条带，或不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。如果扩增结果没有条带，即扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分；各反应成分的用量不当；PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。结果分析与评价用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是（

）A.PCR产物的分子大小在250至500bp之间B.3号样品为不含目的基因的载体DNAC.9号样品对应植株不是所需的转基因植株D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实