第六章 目的基因的分离2014

基因工程的基本步骤

目的基因的获取基因载体的选择与构建目的基因与载体的拼接重组子导入受体分子外源基因的表达和产物的分离第六章目的基因的分离基因工程的上游工程是目的基因的制取和无性繁殖。具体地说是从生物体的组织、器官或细胞制取目的基因，或人工合成目的基因，使目的基因与载体连接，导入受体细胞，筛选和进行无性繁殖。这个过程称为基因克隆（genecloning）。克隆的概念:个体水平上:表示由具有相同基因型的同一物种的两个体或数个个体组成的群体,如双胞胎.细胞水平上:由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体.分子水平上:凡带有一段DNA插入序列的,独特的寄主/载体单元亦叫克隆.比如重组质粒载体克隆基因的方法PCR或人工合成法从基因组文库或cDNA文库中分离基因差减杂交法、扣除杂交、差异显示法

基因文库：指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合按照外源DNA片段的来源，可将基因文库分为：基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）和cDNA文库（complementaryDNAlibrary）。从基因文库中克隆目的基因一、cDNA文库的构建与筛选(一)概念：将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，然后转化给大肠杆菌寄主细胞，这个细胞群体内包含了所有基因编码序列的cDNA分子，被称为cDNA文库。cDNA文库特点只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列。由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定的状态是由特定基因的表达所决定，因此各自的mRNA的种类不同，由此产生出独特的cDNA文库。任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物全部编码基因。

cDNA文库的优越性以mRNA为材料,特别适用于某些RNA病毒筛选比较简单易行.假阳性概率低cDNA克隆可进行原核表达构建cDNA文库应满足的条件文库的代表性:文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性.N=Ln(1-P)/Ln(1-n/T)P:文库中筛选出某一确定克隆的置信度,一般情况下选择0.99.N:文库中以P概率出现细胞中任何一种mRNA序列理论上应具有的最少重组子克隆数;n:细胞中最低丰度的mRNA的拷贝数;T:细胞中表达出的所有mRNA的总拷贝数重组cDNA片段的序列完整性(二)、构建cDNA文库的方法（1）分离细胞总RNA，从中分离出mRNA。（2）以mRNA为模板，逆转录合成第一条cDNA链。（3）将mRNA-DNA杂交分子转变为双链DNA分子。（4）将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体载体上，导入大肠杆菌寄主细胞内增殖。通常用λgt10/λgt11及与其相当的载体来组建非表达的cDNA文库，而一般不用转化效率较低的质粒作载体。cDNA法克隆目的基因的基本战略

cDNA第一链的合成

5‘pppG

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’dNTPs逆转录酶5‘pppG

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’cDNA第一链cDNA第二链的合成

自身引导法：获得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失5‘pppG

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’NaOH煮沸TTTTTTTTTTTTTTp

5’OH

3’KlenowdNTPsTTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAOH

3’S1AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTcDNA第二链的合成

置换合成法：获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’RNaesHDNApoldNTPsAAAATTTOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5’AAAAAAAAAAAAAAp

5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’S1T4-DNAligaseAAAAAAAAAAAAAA5’5’TTTTTTTTTTTTTT3’3’cDNA第二链的合成引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列ppp5’G

AAAAAOH

3’TTTTTp

5’TdTdCTPppp5’G

AAAAACCCCCCCOH

3’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’NaOH退火5‘

pGGGGGGG5‘

pGGGGGGGAAAAAOH

3’KlenowdNTPsTTTTTp

5’双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中:平头末端直接与载体连接,但插入的片段无法回收

平头两端分别接同聚物尾，重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收

以质粒为载体构建cDNA文库以l噬菌体作载体构建cDNA文库的流程图(三)目的cDNA克隆的筛选核酸杂交免疫学杂交检测:通过重组克隆所表达的基因产物筛选目的克隆

如果双链cDNA重组到表达载体上，则cDNA就能随着表达载体而表达出融合蛋白质，这样的文库称为cDNA表达文库PCRcDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构细菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因二、基因组文库的构建与基因分离基因库（genepool）:特定生物体全基因组的集合（天然存在）

基因组文库（genelibraryorgenebank）

将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增.理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因组文库。2.构建基因文库的载体选用载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少目前常用的载体

载体系列：容量为23kbcosmid载体：容量为45kb

YAC：容量为450-1MbBAC:容量为300kb3构建基因组文库应满足的条件（1）文库的完整性:在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：

N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率;f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小

例如，人的单倍体DNA总长为2.9x109bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆（2）基因组信息的可重建性4.基因组文库构建的一般步骤基因组DNA的分离制备DNA大片段的制备:

超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法载体DNA的制备：常用λ噬菌体DNA或粘粒作为载体;双臂的制备，除去非必要区段。载体与基因组DNA大片段的连接体外包装及基因组文库的扩增重组DNA的筛选和鉴定鸟枪法：用生物化学方法，如用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，得到很多在长度上同一般基因大小相当的DNA片段，然后将这些片段混合物随机重组入适当的载体，转化后在受体菌中进行扩增，再用适当的方法筛选出目的基因。用Sau3A限制酶消化真核基因组DNA在l噬菌体载体上构建基因组文库

在酵母人工染色体上克隆DNA基因文库的保存和利用噬菌体及其衍生载体构建的DNA文库的保存:分装,2%-3%氯仿4度保存数月.填加7%的二甲基亚砜,80度保存数年.大片段的基因文库:含抗冻液和抗生素的96孔或384孔无菌培养板保存7.5%的甘油可作为抗冻液.三、PCR扩增获得目的基因使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物1引物设计:决定扩增效果的关键

可在5’端添加限制性内切酶识别序列及保护碱基.引物效果检验和PCR参数确定

退火温度影响最大常规PCR反应的产物一般在3kb以下,主要是因为随着扩增片段延长,扩增效率降低.3设计简并引物和扩增核心区段由TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为TaqDNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆

常规PCR衍生的几种基因克隆技术反向PCR锚定PCR逆转录PCRcDNA末端的快速扩增(RACE)(一)热不对称交错PCR(tail-PCR)也是获得已知DNA序列侧翼未知序列的一种PCR方法设计3个嵌套的特异性引