第1章 组织培养技术的基本理论知识(新修)

组织细胞培养技术主讲：周晓霞司徒镇强

第一章

细胞培养的基本理论知识

组织培养工作开始于20世纪初，Harrison(1907)最早对两栖类胚胎的神经管组织进行了悬滴培养-哈里森悬滴培养法

真正开创大规模细胞培养工作是在20世纪40年代，W.Earle和R.Dulbecco设计出了细胞培养液配方，并开始了单细胞的悬液培养，细胞培养工作才得到广泛发展。

细胞培养始传我国是20世纪30年代。至50年代以后，组织培养已在我国逐步开展起来组织细胞培养的诞生和发展简史

第一节细胞培养基本概念

一、细胞培养(cellculture)基本概念：

动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。

体外培养细胞培养（InVitro）

组织培养

器官培养

一、什么是细胞培养？

(cellculture)

概念体外培养（Invitro）**

细胞培养(cellculture)：

是把取得之组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，然后进行培养生长。**

组织培养(Tissueculture)：

把活体的一小片组织置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。

**器官培养(Organculture)：系将活体中器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。多种学科均可利用细胞培养进行研究，如：细胞学、免疫学、肿瘤学、生化学、遗传学、分子生物学等。可供实验的组织来源众多，包括各种动物的各类组织，可以是动物的胚胎或成体；可以是正常组织或肿瘤组织等。克隆羊多莉克隆猴单克隆抗体制备过程

优点：

1.活细胞：

能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动等

二、细胞培养的优点与缺点2.可控制：

选择对象：均一性、重复性

哪一种：类型：上皮？间质？

性质：正常？肿瘤？

阶段：

调节条件：物理、化学、生物等因素可控

研究方法：可采用各种研究技术、记录方法

3.应用广：学科多，对象广。

4.较经济：

可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相似的实验对象

细胞培养技术的主要优点(小结）㈠研究的对象是活细胞。㈡研究的条件可以人为控制。㈢研究的样本，可以达到比较均一性。㈣研究的内容便于观察、检测和记录。㈤研究的范围比较广泛。㈥研究的费用相对较经济。缺点：虽然现在人工模拟体内环境的技术已经很高,但人工所模拟的条件与体内实际仍不完全相同。当细胞被置于体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境中久了，必然发生变化。１.与体内主要不同相对孤立、相对单一，缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。2.主要表现

失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，细胞趋向单一化；3.提示

要正确认识体外培养细胞：是一种特定条件下生长的细胞群体。

体内、外细胞的差异:体内细胞：

机体神经体液调节和其他类型细胞影响

基因表达受到外来信号调节

增殖过程中不断发生着分化（由一般到特殊）

高度特化的结构和功能体外细胞：失去机体神经体液调节和其他类型细胞影响细胞的许多外来信号被切断特定分化基因表达减弱或停止而进化中保守的增殖活动维持（由特殊到一般）与体内细胞结构和功能的差异特征：失去原有形态，分化特性减弱，形态和功能趋于单一，一定代数后衰老死亡，或发生转化，获不死性而成为能无限传代

第二节组织培养的细胞生物学

一、体外培养细胞的生长类型

按生长方式分为二型

粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。

悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。

绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。

粘附型细胞：粘附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式

有机体的绝大多数细胞必须粘附于一固相表面才能生存和生长。

细胞在体内、外的粘附方式存在差异：

体内：粘附是全方位，外形具有复杂的立体特征

体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同按照培养细胞的主要形态，可分为以下类型：

(1)上皮型细胞(2)成纤维型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞

(1)上皮型细胞(2)成纤维型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞

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上皮样细胞型

名称：凡在培养中形态与上皮细胞类似的细胞来源：来源于外胚层，内胚层细胞（个别例外）如：皮肤及其衍生物消化道，乳腺，肺泡，上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核

生长特点:易相连成片:相靠—紧密相连—成薄层—铺路石状;生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动

成纤维细胞样细胞

名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的细胞来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞心肌，平滑肌，成骨细胞，形态：似体内成纤维细胞的形态胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出2—3个长短不等的突起中有卵圆形核

生长特点:

排列成放射状，漩涡状并不紧靠连成片;细胞—细胞接触易断开而单独行动游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起

体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞游走型细胞

具有类似巨噬细胞样的特征。经常处于较活跃的变形及游走状态，因此外形不规则且不断变化。当细胞密度增大相互连接成片时，游走受限，形状上类似上皮型细胞或成纤维细胞型的细胞。表现这种形态的细胞主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肝库佛细胞(Kupffercell)以及某些肿瘤细胞等。

多形型细胞

多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，但它不像成纤维细胞型的细胞那样，不规则形态由宽扁的胞质突起所致。其细胞一般分胞体和胞突两部分。胞突为细长形，似丝状伪足。胞体虽略呈多角形，但没有成纤维细胞型那样不规则。体外培养中呈现多形型的细胞最常见的类型是神经元和神经胶质细胞。注意：细胞形态并非固定不变，可随培养条件、生长时期、细胞数量等而变化细胞形态只是对培养物判断或识别的参考指标若要确定某一培养物的确切细胞类型，必须借助更为特异的鉴定方法，如进行组织化学或免疫细胞化学染色鉴定。培养细胞形态不稳定:条件改变，细胞形态可有变化

血清高血清低血清

Hela成纤维细胞样上皮样细胞

pH

太酸或太碱标准pH

Hela成纤维细胞样上皮样细胞

细胞密度低密度高密度

3T3成纤维细胞样上皮样细胞

生长状态改变

悬浮或贴附悬浮贴附

3T3圆形成纤维或上皮样

转化与否未转化转化后3T3成纤维样可成上皮样悬浮生长型

概念培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长来源来自血，脾或骨髓，主要是血中白细胞肿瘤细胞也可能特点在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点:

生存空间大，提供数量大传代方便(不需消化)易于收获缺点:

观察不方便很多细胞不能悬浮生长(尤其是正常细胞)

小结*：体外培养细胞的生长类型粘附型细胞悬浮型细胞：血细胞以及某些肿瘤细胞

上皮型细胞成纤维型细胞

游走型细胞

多形型细胞

培养细胞分化状态的变化分化特征逐渐减弱，原本各种各样的分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能“个性”，表现出某种趋同性，这种现象被称为去分化或脱分化培养细胞的增殖能力

分裂增殖和生长发育是体外培养细胞的两大生命特征;增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿。

根据增殖状况，体内细胞分三类：·连续分裂细胞(cyclingcell):这类细胞始终保持着活跃的分裂能力。如造血组织，胃肠粘膜上皮，体表皮细胞等。特点：细胞代谢旺盛，寿命较短，更替快。

·休眠细胞(Go细胞):在平常情况下它们不进行分裂，如肝、肾、甲状腺等细胞，但在一定条件下，可以重新进入细胞周期，出现活跃的细胞分裂。·终末分化细胞:终生不再分裂。二、培养细胞的生长和增殖过程１）单个细胞的生长过程：ＤＮＡ合成细胞分裂

复习：细胞周期＝Ｇ１＋Ｓ＋Ｇ２＋Ｍ细胞通过什么方式增殖？细胞以分裂的方式进行增殖细胞增殖一个细胞周期分四个时期：G1、S、G2、M期。G1SG2MG0

概念：连续分裂的细胞，从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止，为一个细胞周期。细胞周期

阶段分裂间期：G1、S、G2分裂期：

M期前期中期后期末期

细胞沿着G1→S→G2→M→G1周期性运转，在间期细胞体积增大(生长)，在M期细胞先是核分裂，接着胞质分裂，完成一个细胞周期。一次分裂结束下次分裂开始下次分裂结束分裂间期分裂期细胞周期①细胞的种类不同，一个细胞周期的时间也不相同。②分裂间期的时间远远大于分裂期的时间。（90%--95%）

（5%--10%）规律:细胞周期中各期的生化特点:G1期：从有丝分裂完成到DNA复制之前这一阶段，又称为复制前期。该期细胞内各种RNA、蛋白质、糖、脂等合成增多。同时该期是各种细胞群体之间细胞周期的差异取决于此期。S期：又称为DNA合成期或复制期。该期细胞内遗传物质从二倍体到四倍体。同时组蛋白的合成也同时进行。G2期：指DNA合成完成到有丝分裂开始这段时间，又称复制后期。该期DNA合成已终止，但仍然进行着RNA和一定蛋白合成。同时线粒体DNA在此期复制。M期：又称为有丝分裂期。此期细胞呈球形，染色体在此期凝聚后分开，移向细胞两端，解聚并再形成两个完整的核，最后