第16章 新方法、新技术-2013

药物分析学(第21章)药品质量控制中的现代分析方法的进展(NewAnalyticalMethod&TechintheQCofPharmacy)

主讲韩海教学要求熟悉手性分离色谱法、高效毛细管电泳分析法、超高效液相色谱法的原理与其在药物分析中的应用范围。了解其他新技术在药物分析中的应用

药物分析药物分析测定手段药物分析方法药物质量规律检验控制利用发展研究科学药物分析方法技术的发展神农尝百草：外观；色味等感官反应和治疗效果分析；19世纪：天然产物的分离鉴定与应用。形成现代化学制药工程；20世纪70年代以前：容量分析；之后：色谱分析；仪器分析时代；20世纪90年代：色谱-光谱等现代联用技术进一步发展；现在：进一步向前发展！分析测定手段HPLCNMRIRUVHPCECDTLCMSABSFLAAndothermethods……………..UPLCXRDSEM化学法容量法物理法生物法NIRGCDSCTGA药品质量控制中的分析方法

化学方法

仪器方法容量分析法重量分析法光谱法色谱法电化学法最常用、最重要的分析方法

现代分析方法与技术，为药学的发展提供了适时而有效的手段与动力。 色谱及其联用技术：

药学研究－－分子水平。手性分析：毛细管电泳及手性色谱技术－－药物研究与质量控制提供了保障。现代光谱技术：药物结构鉴定，微量杂质检定。药品质量控制中的现代分析方法

一、毛细管电泳分析法二、UPLC(超高效液相色谱法)三、手性药物的液相色谱分离法

四、GC-MS五、LC-MS六、LC-NMR七、近红外光谱技术（简介）高效毛细管电泳（HPCE）经典电泳技术现代微柱分离优点：

1.高效2.高速3.微量4.低消耗Capillaryelectrophoresis,CE－－－－－－－－－－－－－－－－－－++++++++++++++++++++++++++(－)(+)电泳流：带电离子在电场中以不同速度向其所带电荷相反的方向迁移。电渗流：双电层的水和阳离子集体向负极运动★原理：－－－－－－－－－－－－－－－－－－(－)(+)++++++++++++++++----------------★特点：1、流出顺序：阳→中→阴2、电渗为驱动力，流型为平塞型，谱带不扩张。柱效优于HPLC法。v=veo+vep=(μeo+μep)E电渗流驱动与压力驱动比较平塞型抛物线型主要分离模式1.毛细管区带电泳（CZE）2.胶束动电毛细管色谱（MECC）3.毛细管凝胶电泳（CGE）4.毛细管等电聚焦（CIEF）毛细管等电聚焦根据蛋白质的等电点不同而进行分离。AAAAAABBBBBBCCCCDDDDDEEEEEFFAAAABBBBCCCCDDDDEEEEFFFFpH梯度高低模式缓冲液体系分离机理CZE自由缓冲液离子淌度MECC胶束－缓冲溶液疏水性/离子性相互作用CGE凝胶－缓冲溶液分子大小和荷电数目CIEF两性电解质等电点应用范围1.毛细管区带电泳最基本、最广泛的分离模式。

适用于所有具有不同淌度的荷电粒子的分离，但不能分离中性物质及质荷比相同的组分。2.胶束动电毛细管色谱

用离子胶束溶液代替缓冲溶液，使中性组分可按其疏水性的不同及在两相间的分配系数的不同而分离。采用手性分配相，可用于手性化合物的分离。3.毛细管凝胶电泳凝胶网络结构对溶质具有分子筛的作用，可分离质荷比相同但分子大小不同的组分。在分子生物学和蛋白质化学上有着十分广泛的应用。4.毛细管等电聚焦

根据蛋白质的等电点不同而进行分离。UPLCUltraPerformanceLC®(UPLC®)technologystartswithunique1.7µmsmall-particlechemistries.Chromatographersnolongerneedtochoosebetweenspeedandresolution—withUPLCyougetboth.超高效液相色谱的发展大量的样品需要在很短的时间内完成在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求必须从理论高度对液相色谱重新认识提高HPLC的分离能力（1）小颗粒、高性能微粒固定相的出现（2）超高压输液泵的使用；

（3）高速采样速度的灵敏检测器；

（4）使用低扩散、低交叉污染自动进样器，配备了针内进样探头和压力辅助进样技术分析速度快灵敏度高分离度好超高效液相色谱的优点0.000.040.080.120.160.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.001.Thiourea-0.4302.toluene-1.0343.propylbenzene-1.7424.butylbenzene-2.4135.hexylbenzene-5.058

样品的组份数：55µm颗粒度完全分离时间：6.00分钟0.200.241.Thiourea-0.0462.toluene-0.0883.propylbenzene-0.1374.butylbenzene-0.1825.hexylbenzene-0.360UPLC™AU0.000.100.20Minutes0.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.550.60UPLC™HPLC样品的组份数：51.7µm颗粒度完全分离的时间：0.60分钟UPLC的速度提高了！增加了样品的通量0.00AU使用1.7µm颗粒度的填料增加灵敏度可看到更多的样品信息AU0.0000.0040.0080.0120.0160.020Minutes1.701.801.902.002.102.202.302.402.502.601.7µmAU0.0000.0100.0200.0300.0400.050Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.00AU0.0000.0100.0200.0300.0400.0505.0µm0.024恒定柱长时；UPLC™的灵敏度提高1.7倍（170%）！UltraPerformanceLC

速度、灵敏度与分离度的结合HPLC3.5µmUPLC™1.7µm对流出时间接近的色谱峰有更好的分离度及更高的灵敏度生产力：每次实验得到更多信息AUAU在高效液相色谱速率理论中，VanDeemter方程式的简化表达式：如果仅考虑固定相的粒度

对

的影响，其简化方程式可表达为：UPLC理论基础vanDeemter曲线带来的承诺如果填料的颗粒继续演变……更小的颗粒度……填料颗粒尺寸的演变前景：2.1×100mm色谱柱1.5µm杂化填料颗粒可达到15,000psi通常有每米200,000理论塔板数的柱效速度、灵敏度及分离度的完美结合Minutes1.000.000.200.400.600.80AU0.0000.0200.040一分钟以内！UPLC仪器介绍检测器：光学及/或质谱检测器可调紫外或光电二极管矩阵为UPLC™专门优化的流动池高速检测色谱柱管理：创新的枢轴转动设计置色谱柱出口直接到检测器样品管理器：低扩散XYZZ’形式快速进样周期低交叉污染样品盘及/或样品瓶可选样品组织器两元溶剂管理：高压混合两元梯度四溶剂选择在线脱气低扩散设计

UPLC的耐压能力超高效液相色谱的C18色谱柱固定相粒度直径可达1.7µm色谱柱长可达3-5cm色谱柱颗粒化学在杂化的碳-硅基质内具有桥式乙烷的1.7µm颗粒三官能团键合C18配体改善了高pH稳定性改善了硅胶的柱效和反压改善了低pH稳定性色谱柱硬件筛板、柱管和连接件，可在超过140MPa压力下装填，保证色谱柱高柱效和长寿命。超高效液相色谱的高速检测器UPLC光导检测器流通池示意图采样速度快能减少谱带扩展以保持柱效灵敏度比HPLC提高2-3倍流通池体积小、池壁全折射而不损失光能量超高效液相色谱的应用药物分析

如天然产物中复杂组分的分析

生化分析

如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品食品分析如食品中农药残留的检测环境分析

如水中微囊藻毒素的检测其他

如化妆品中违禁品的检测UltraPerformanceLC™

－代谢物分析HPLCUPLC™超高效液相色谱的展望UPLC可以更快的速度和更高的质量完成以往HPLC的工作，为用户节省宝贵的时间和日常溶剂消耗，从而获得最大的投资回报。UPLC的高分离度可从容面对复杂组份（如蛋白质与代谢组学等生化领域、天然产物）分离的挑战。UPLC的高灵敏度可检测更加痕量的目标化合物。UPLC的快速分析大量样品，实现高通量。手性(chirality)这个词来源于希腊字“手”(cheir)。

手是手性的—右手与左手成镜像。手性是三维物体的基本属性。如果一个物体不能与其镜像重合，该物体就称为手性物体。手性手性药物液相色谱分离法有机分子手征性的发现1848年，法国化学家巴斯顿（L.Pasteur,1822～1895）发现酒石酸两种不同的存在形式：

左旋酒石酸

右旋酒石酸图：巴斯顿把酒石酸晶体分开成两个镜像异构体一、手性药物的现状ChP手性药物是指由具有药理活性的手性化合物组成的药物反应停:五十年恩怨(R)-thalidomide(S)-thalidomide手性与人类健康:“反应停”悲剧沙利度胺的S-异构体可导致严重的致畸性

1957年～1962年，造成数万名婴儿严重畸形。

进一步研究表明，其致畸作用是由沙利度胺其中的一个异构体（S-异构体）引起的，而R-构型即使大剂量使用，也不会引起致畸作用。图：沙利度胺的另一个对映体可导致严重的致畸性。二、手性药物对映体的药效学差异一对对映体中的两个化合物都有等同的或近乎等同的定性和定量的药理活性；只有一种对映体具有所要求的药理活性，而另一种对映体则没有显著的药理作用；各种对映体具有定量上不同的活性;两种对映体具有定量上等同，但定性上不同的活性。

新世纪的第一个诺贝尔化学奖手性催化氢化反应和手性催化氧化反应二、手性药物对映体的药动学差异1.吸收2.蛋白结合3.代谢手性药物的研究开发过程中，单个对映体的药效、毒性、不良反应的评价及药动学的研究对映体药物的血药浓度与临床疗效关系的研究对映体药物的质量标准的制定和质量控制必须建立分离测定对映体药物的方法手性药物HPLC拆分机理“三点手性识别模式”

提供一种手性源，使待拆分的对映异构体（样品）、手性作用物（如固定相）和手性源之间形成一个非对映异构分子的络合物。

手性对映体的分离必须满足的条件是作用物二者间至少有三个作用力（点）存在，并且其中的一个是选择性的（立体的）,立体点之间的作用可以是氢键、偶极-偶极作用、π-π作用、静电作用、疏水作用或空间作用，作用方向可以是吸引也可以是排斥。CA′′BCACAB对映体立体选择点′′BA氨基、羧基、R三点（平面）手性药物的HPLC分析柱前手性衍生化法CDR手性流动相法CMP手性固定相CSP