第四章 微生物的生长

第4章微生物的生长一、微生物生长的概念生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用>异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。发育——从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）个体生长→个体繁殖→群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖获得纯培养的方法二、微生物生长量的测定纯培养(pureculture)——微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养。

首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物。这种方法适合于细胞较大的微生物。①液体稀释法②平板划线分离法（StreakPlate）特点：快速、方便。

分区划线（适用于浓度较大的样品）

连续划线（适用于浓度较小的样品）连续划线划线分离后平板上显示的菌落照片③平板涂布分离法（SpreadPlate）简单易行，但易造成机械损伤④选择性培养分离法

为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。＊利用选择培养基进行直接分离＊富集培养⑤单细胞（单孢子）分离法采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。微生物纯培养生长的测定方法

描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标。（一）微生物生长量和生理指标测定法直接法(干重法，测体积法)间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）（二）微生物细胞数目的检测法直接法（血球计数板、比例计数法）间接法（活菌计数法、液体稀释法、膜过滤法）1.直接法（测体积）将待测微生物培养液放在刻度离心管中进行一定时间的离心或自然沉降，然后观察微生物细胞沉降物的体积。（一）微生物生长量和生理指标测定法2.直接法（干重法）将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105℃、100℃或80℃)、称重。一般干重为湿重的10%—20%，而一个细菌细胞一般重约10-13—10-12g。该法适合菌浓较高的样品。举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10–13~10–12g，液体培养物中细胞浓度达到2×109个/ml时，100ml培养物可得10~90mg干重的细胞。3.间接法（生理指标法）测含氮量

蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。其他方法

含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。4.间接法（比浊法）原理:在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。1.直接法（比例计数法）方法：将已知颗粒浓度的液体与待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，然后镜检各自的数目，求出未知菌液中的细胞浓度。（二）微生物细胞数目的检测法2.直接法(血球计数板法)原理：将1mm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。最常用的活菌计数法:将适当稀释的菌液倾注平板或涂布在平板表面，经保温培养后，以平板上出现的菌落数乘以稀释度就可以计算出原菌液的含菌量。直径9cm的培养皿平板上出现菌落数一般以50-500为宜。按照国家标准规定的样品菌落总数测定的计数原则，以平板菌落数在30-300之间为报告依据。3.间接法（平板菌落计数法）1ml 1ml 1ml 1ml 9ml 9ml 9ml 9ml1ml 1ml 1ml×2 ×2 ×2★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完成操作），严格无菌操作；★注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；★适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物;★误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作.4.间接法（液体稀释法）对未知样品作10倍系列稀释。选适宜的3个连续的稀释液各取3ml，接种到3组共9支液体培养基试管中，每管接入1ml，培养一定的时间后，记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查表，根据样品的稀释倍数可计算出其中的活菌含量。由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时（Ｇenerationtime,G），代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需时间，有时也称为倍增时间。右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况。右图可见，每经过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是单细胞群体生长的特征。三、微生物的群体生长规律

将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。生长曲线的制作接种 适温培养定时取样测定生长量典型的生长曲线

（Growthcurve）延滞期对数期稳定期衰亡期时期的划分：按照生长速率常数（growthraceconstant）不同该生长曲线只适用于单细胞微生物，包括细菌和酵母菌。适应期对数增长期稳定期衰亡期又叫适应期、缓慢期或调整期，是指把少量微生物接种到新鲜培养基时，通常不会出现立即生长，经历一个短的时期才生长。适应期的出现，可能是因为在接种到新鲜培养液的细胞中，一时还缺乏分解或催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢物。该时期有几个特点：①生长繁殖的速度几乎等于零；②细胞形态增大，DNA含量增多，为分裂作准备；③细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性；④合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶；⑤对外界不良条件反应敏感。影响适应期长短的因素很多，除菌种外，主要有三。1．菌种的菌龄菌龄即“种子”(inoculum)的群体生长年龄，亦即它处在生长曲线上的哪一个阶段。2．接种量接种量的大小明显影响适应期的长短。3．培养基成分（一）延滞期（lagphase）认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：◆在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期；采取的缩短延滞期的措施有：①增加接种量；（群体优势----适应性增强）②采用对数生长期的健壮菌种；③调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。④选用繁殖快的菌种◆在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌又称为指数增长期（exponentialphase），是指在生长曲线中，紧接着适应期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期。对数增长期有以下几个特点：①生长速率常数R最大，世代时间均匀一致，代时最短；②细胞进行平衡生长，菌体各部分的成分均匀；③酶系活跃，代谢旺盛；④细胞群体的形态与生理特征最一致，最具代表种的特征；⑤抗不良环境的能力最强。

适应期对数增长期稳定期衰亡期（二）对数增长期(logarithmicphase)对数期常用的三个参数繁殖代数（n）指数生长方式：1248……2n

设接种时细胞数为x1,时间为t1,到时间t2后，繁殖n代，细胞数为x2，它们之间的相互关系为：x2=x1*2n以对数表示：㏒x2=㏒x1+n㏒2㏒x2-㏒x1∴n==3.322(㏒x2-㏒x1)㏒2生长速率常数（R）

n3.322(㏒x2-㏒x1)

R==t2–t1t2–t1代时(G)1t2–t1G==R3.322(㏒x2-㏒x1)★代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。★代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为1~3h,然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。应用意义：①由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。★影响指数期代时长短的因素：◆菌种:不同菌种其代时相差很大；◆培养基成分:在营养成分丰富的天然培养基上生长的代时比在合成培养基上生长时短；◆营养物浓度◆培养温度营养物浓度与对数期生长速率和产量作用方式：影响微生物的生长速率和总生长量生长限制因子：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物就称生长限制因子8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收获量受影响生长速度和最大收获量受影响时间细胞数或菌体量培养温度对代时的影响温度/℃代时/min温度/℃代时/min108603522151204017.520904520254047.5773029适应期对数增长期稳定期衰亡期又叫最高生长期或恒定期，特点是：①新繁殖的细胞数与衰亡细胞数几乎相等，即是正生长与负生长达到动态平衡，此时生长速度逐渐趋向于零，培养物中的细胞数目达到最高值；②细胞内开始积累糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物等；③大多数能形成芽孢的细菌在此时期内形成芽孢；④此时期的微生物开始合成次生代谢产物，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。稳定期到来的原因主要是：①营养物尤其是生长限制因子的耗尽；②营养物的比例失调，例如C/N比值不合适等；③酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积；④pH、氧化还原势等环境条件越来越不适宜等。如何延长稳定期，促进代谢产物的积累，对稳定期到来的原因进行研究，还促进了连续培养技术的设计和研究。（三）稳定期（stationaryphase）应用意义：1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充营养物质（补料）；调pH；

调整温度

2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。适应期对数增长期稳定期衰亡期特点：

①在衰亡期中，个体死亡的速度超过新生的速度，群体中活菌数急剧下降，整个群体就呈现出负生长(R为负值)。②在这个时期内，细胞形态出现不正常，呈多样性，例如会产生很多膨大、不规则的退化形态；③有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应为阳性的变成阴性；④有的微生物因蛋白水解酶活力的增强就发生自溶(autolysis)，芽孢释放往往也发生在这一时期。在衰亡期，菌细胞很容易发生变异产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡.（四）衰亡期（declinephase）微生物的连续培养

分批培养（batchculture）：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。连续培养（continuousculture）：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。连续培养理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。单批培养恒浊法恒化法

单批培养 连续培养 时间连续流入新鲜培养液lg细胞数（个/ml）连续培养

连续培养原理优点：①高效，它简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等许多单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率；②自控，便于利用各种仪表进行自动控制；③产品质量较稳定；④节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均匀合理。概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。1.连续培养技术——恒浊培养使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。2.连续培养技术——恒化连续培养概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。应用范围：实验室科学研究恒化器（Chemostat或bactogen）装置控制对象培养基培养基流速生长速率产物应用范围恒浊器菌体密度（内控制）无限制生长因子不恒定最高大量菌体或与菌体形成相平行的产物生产为主恒化器培养基流速（外控制）有限制生长因子恒定低于最高不同生长速率的菌体实验室为主恒浊法与恒化法的比较连续发酵（continuousfermentation）连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。优点：自控：便于利用各种仪表进行自动控制；高效，简化了操作——装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；产品质量稳定节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月－1年。微生物的同步培养同步生长的概念：采用一定的方法使细胞群体处于分裂步调一致的状态，称为同步生长

通过环境条件诱导同步生长群体获得同步生长的方法（温度、培养基成分等）

通过物理方法选择同步生长群体

（离心方法、过滤分离、硝酸纤维素滤膜）硝酸纤维素薄膜法原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。四、环境因素对微生物生长的影响温度氧气辐射

物理因素干燥渗透压超声波与微波

酸、碱与pH

重金属及其化合物表面消毒剂有机化合物（酚类、醇类、醛类）卤族元素及其化合物表面活性剂（新洁尔灭、杜灭芬）化学因素染料抗代谢药物：磺胺类等化学治疗剂抗生素

中草药有效成分有关术语防腐：利用一些理化因素使物体内外的微生物暂时处于不生长繁殖但又未死亡的状态。消毒：杀死所有病原微生物的措施。灭菌：用物理或化学因子，使存在于物体中所有的微生物永久性地丧失其生活能力。商业灭菌：食品经过杀菌处理后，按照所规定的微生物检验法，在所检食品中无活的微生物检出，或者仅能检出极少数的非病原微生物，并且它们在食品保藏过程中，不能进行生长繁殖。有关术语无菌：没有活的微生物存在。死亡：微生物不可逆的丧失了生长繁殖的能力，即使再放到合适的环境中也不再繁殖。温度是影响微生物生长的最重要因素之一。温度对微生物的影响具体表现在：影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。影响物质的溶解度，对生长有影响。一、温度对微生物生长的影响1.温度从微生物整体来看:生长的温度范围一般在-10℃~100℃极端下限为-30℃，极端上限为105~300℃但对于特定的某一种微生物：只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度。处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。超过最低生长温度时，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡。超过最高生长温度时，微生物不生长，温度过高，甚至会死亡。二、微生物生长的三个温度基点

菌名 生长温度 发酵温度 累积产物温度

（℃） （℃） （℃）

Streptococcusthermophilus

37 47 37S.lactis 34 40 产细胞：25~30 产乳酸：30Streptomycesgriseus

37 28 _Corenybacteriumpekinense

32 33~35 _Clostridiumacetobutylicum

37 33 _Peniciliumchrysogenum

30 25 20不同生理生化过程的最适温度微生物不同生理活动要求不同温度，所以，最适生长温度≠发酵速度快、积累代谢产物多。以青霉素的生产为例：培养165小时采用分段控制温度的方法，其青霉素产量比始终在30℃培养提高了14.7%。分段控制方式：0-5小时，30℃；5-40小时，25℃；40-125小时，20℃；125-165小时，25℃。根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为三个类型：三、微生物生长温度类型低温型微生物（嗜冷微生物）中温型微生物（嗜温微生物）高温型微生物（嗜热微生物）低温型微生物:最适生长温度在5~20℃,主要分布在地球的两极、冷泉、深海、冷冻场所及冷藏食品中。例：假单孢菌中的某些嗜冷菌在低温下生长，常引起冷藏食品的腐败。嗜冷微生物在低温下生长的机理，目前还不清楚，据推测有两种原因：①它们体内的酶能在低温下有效地催化，在高温下酶活丧失②细胞膜中的不饱和脂肪酸含量高，低温下也能保持半流动状态，可以进行物质的传递。当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微生物的生长繁殖停止，当微生物的原生质结构并未破坏时，不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复正常的生命活动。低温保藏菌种就是利用这个原理。一些细菌、酵母菌和霉菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4℃的冰箱中。当温度过低，造成微生物细胞冻结时，有的微生物会死亡，有些则并不死亡。低温对微生物的影响造成死亡的原因：①冻结时细胞水分变成冰晶，冰晶对细胞膜产生机械损伤，膜内物质外漏。②冻结过程造成细胞脱水。

冻结速度对冰晶形成有很大影响，缓慢冻结，形成的冰晶大，对细胞损伤大；快速冻结，形成的冰晶小、分布均匀，对细胞的损伤小，因此，利用快速冻结可以对一些菌种进行冻结保藏，一般情况下在菌悬液中再加一些甘油、糖、牛奶、保护剂等可对菌种进行长期保藏。低温的用途菌种保藏

液氮的温度（-195℃）、干冰温度（-70℃）、-20℃和4℃（常加大分子保护剂如糊精、血清白蛋白等）食品冷藏冷藏（0-4℃）与动藏（-18℃）

中温型微生物：最适生长温度为20℃~40℃，大多数微生物属于此类。室温型主要为腐生或植物寄生，在植物或土壤中。体温型主要为寄生，在人和动物体内。高温型微生物：最适生长温度为50℃~60℃,主要分布在温泉、堆肥和土壤中。在高温下能生长的原因：①酶蛋以及核糖体有较强的抗热性②核酸具有较高的热稳定性（核酸中G+C含量高（tRNA），可提供形成氢键，增加热稳定性）。③细胞膜中饱和脂肪酸含量高，较高温度下能维持正常的液晶状态。高温微生物的特点:生长速度快，合成大分子迅速，可及时修复高温对其造成的分子损伤。生长曲线的各个时期均短暂，因此常会在腐败食品中检测不到，这在食品检验中要特别注意。耐高温菌具应用优势：在减少能源消耗、减少染菌、缩短发酵周期等方面具重要意义。

热对微生物的致死作用高温对微生物的影响高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构（溶菌）。微生物耐热性大小的几种表示方法：

热力致死时间（TDT）：在特定的条件和特定的温度下，杀死一定数量的微生物所需要的时间。

D值：在一定温度下加热，活菌数减少一个对数周期（即90%活菌被杀死）所需要的时间。

Z值：在加热致死曲线中，时间降低一个对数周期（即缩短90%的加热时间）