第五章核酶与抗体酶2010

第五章核酶与抗体酶

第一节核酶

一、概述

（一）核酶的发现及磷酸酯基的转移反应

酶（enzyme):是生物体内一类具有催化活性的生物大分子物质，包括蛋白质和核酸等。

核酶(ribozyme):生物体内能够催化生化反应的核酸类物质（又称为催化RNA）。核酶在许多基本的生物过程中都起着重要作用。这些生物过程包括:1、RNA的自我裂解(selfcleavage)2、自我剪接(selfsplicing)3、tRNA的转录后加工4、肽键的形成5、染色体DNA终端的合成等

核酶的发现:

1982年美国T.Cech等人发现四膜虫rRNA前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现RNA有催化活性。rRNA自我剪接反应机制---磷酸酯基的转移反应。反应的特殊性在于它既不需要能量的供给也不需要蛋白质酶的催化即可进行，而只需要在四膜虫rRNA的自我催化下进行。反应所需的辅助因子是1个鸟苷酸分子和1个金属离子。四膜虫rRNA前体(约6400个nt)很不稳定，在鸟苷(或5’—GMP)和Mg2+存在下切除自身的413个核苷酸的内含子(intron)，使两个外显子(exon)拼接起来，变成成熟的rRNA分子，自我剪接(self-splicing)，证明了RNA具有催化功能。

1983年美国S.Altman等研究RNaseP（由20%蛋白质和80%的RNA组成），发现RNaseP中的RNA可催化E.colitRNA前体加工。

SidneyAltman

ThomasCech

Cech和Altman各自独立地发现了RNA的催化活性，并命名这一类酶为ribozyme（核酶），2人共同获1989年诺贝尔化学奖。1．Cellvol31,147～157，1982年。

2．Sci.Amer.Vol255,64～75，1986。

核酶发现的意义：

1、开辟了生化研究的一个崭新领域。发现了多种天然和人工合成的核酶。这些核酶具有水解酶、激酶、氨基乙酰转移酶等各种酶促活性。2、使人们开始重新思考生命起源的问题。设想，生命也许是从RNA开始的。在蛋白质尚未出现之前，RNA不仅起着传递遗传信息的作用，而且也负责催化生化反应。随着蛋白质的出现，核酶的催化作用才渐渐地被功能更完善的蛋白酶所取代。

根据天然核酶锤头状、发夹状、斧头状结构特性，人工合成的核酶，其特异性序列通过碱基配对识别并结合靶RNA，催化裂解靶RNA，抑制基因表达，特别是有害基因的表达。

核酶具有序列特异性，不编码蛋白而无免疫性，又可重复利用等优点。

(二)核酶与蛋白质酶的比较

结构上

1、蛋白质酶的一级结构比核酶复杂蛋白质酶是由20多种不同的氨基酸组成的多肽聚合物，而核酶是由4种核苷酸组成的聚合物。2、几个氨基酸可以形成1个蛋白质酶的三维结构，且蛋白质酶的活性中心具有刚性由4种核苷酸组成的核酶不具蛋白质酶的这些特性。3、核酶需要较大的结构才能提供较稳定的活性中心，从而有效地提高反应速率，小的核酶结构只能勉强满足催化反应的要求。反应机制上

1、普通酸碱催化与金属离子催化：

蛋白质酶与核酶都可以催化磷酸酯键的水解反应。蛋白质酶催化的磷酸基水解反应机制同普通酸碱催化，其活性中心是蛋白质本身的某些氨基酸；核酶也采用普通酸碱催化机制催化磷酸酯键的水解反应，但其活性中心却是金属离子。

2、共价催化

在某些蛋白质酶催化的反应中，反应是通过酶侧链上的活性功能团与反应底物瞬时形成共价键形式的活泼中间过渡态而进行的。共价中间过渡态的形成可以使一个本来需要很高活化能的反应分解成两步或多步各需较小活化能的反应。

酶分子上的亲核基团有Ser-OH、Cys-SH、His-咪唑基等，这些富含电子的基团，攻击底物分子中电子云密度较小的亲电子基团，并供出电子，二者形成共价键，酶和底物形成一个不稳定的中间物，进而转变为产物。酶分子中三种主要的亲核基团共价催化可以分成三类：

第一类：亲核基与最终的受体的反应活性相似。

第二类：亲核基较最终的受体活泼很多。

第三类：底物与亲核基形成的共价加成物会增加底物的反应活性，从而加速反应的进行。在四膜虫内含子基础上人工筛选的核酶采用了第一类共价催化方式。

3、酶催化反应中的辅助因子：蛋白质酶催化反应可用辅助因子调节和控制反应的进行。目前还没有发现天然核酶利用辅助因子调节和控制反应，但已发现有些人工筛选的核酶利用辅助因子，如ATP等调控反应。

研究结果表明蛋白质酶比核酶能更有效地利用辅助因子调控催化反应。从生物进化的角度看，蛋白质酶是比核酶更高级的生物催化剂。通过人工筛选，人类也许在将来能够制造出更有效地利用辅助因子的核酶。4、利用内在结合能进行催化反应利用内在结合能进行催化反应是所有生物催化反应的共同特点。蛋白质酶利用结合能将反应底物准确地固定在反应活性中心。核酶也是利用结合能将底物固定在核酶的反应活性中心，但其效率远低于蛋白质酶。因为，底物的固定需要一个刚性的接合部位，而与蛋白质酶相比，RNA的立体结构难以形成一个刚性结构。酶的活性中心酶的活性中心

核酶既是催化剂又是底物，随着反应的进行，本身也消失了，而蛋白酶则不同，仅催化反应，反应前后其本身的质和量都不发生变化。剪切型核酶剪接型核酶根据催化反应锤头核酶I型内含子II型内含子发夹核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP二、核酶的分类

第一类内含子(groupIintron)

Cech等于20世纪80年代发现四膜虫rRNA核酶，这是第一类内含子。它位于核糖体大亚基的rRNA中一个一级结构高度保守的区域。现已发现的第一类内含子有300多个。催化的自我剪接为磷酸基团的转移反应；剪接过程需要鸟苷或鸟苷酸作为辅助因子；一级结构相似性很小；具有类似的二级结构。特点第一类内含子都有10个结构相似的双螺旋区域，它们被命名为双螺旋结构P1～P10。这10个双螺旋区域分别被单链与突环区域隔离开来。边界序列为5’U……3‘G，为剪切位点；P4和P7为共有的保守序列；P3、P4、P6和P7为核心结构，即执行催化的最小区域；内部引导序列（IGS）。Michel和Westhof提出了一个为大多数科学家认可的第一类内含子三维结构模型。

Ⅰ类内含子二级结构通式保守序列G结合位点剪接部位引导序列

由于第一类内含子催化核心的高度相似性，所以第一类内含子都遵循以下相同的反应机制：第一步:

游离的G的3’－羟基亲核性地进攻5’外显子与内含子之间的磷酸基团，进而与内含子的5’一末端共价相连。被切下的5’外显子仍保持在底物位点上；第二步:

已释出的5’外显子的3’－OH进攻内含子与3’外显子之间的磷酸基团，切开磷酸二酯键，外显子连接起来。第三步：内含子成环。

在GroupI内含子切除体系中，鸟苷或鸟苷酸的3'-OH作为亲核基团向Intron5'的磷酸二酯键发起进攻。

自我剪接的结果是两个外显子被连接起来，而内含子被释放出来。第一类内含子的催化核心分别与3个反应底物按以下顺序相互作用：游离的G、5’外显子与内含子之间的磷酸基团、内含子与3’外显子之间的磷酸基团。

第一类内含子已被应用于治疗某些由基因突变造成的遗传性疾病。可将正确的基因引入细胞内，通过剪接将突变的基因片段取代出来。第二类内含子(groupⅡintron)

第二类内含子在植物和低等真核生物的细胞器基因组中发现并起作用。在生物体外，没有蛋白质帮助可有效地进行剪接。

在生物体内，只有与蛋白质结合才能更为有效地发挥催化作用，但起催化作用的还是RNA，蛋白质的作用是帮助稳定具有催化活性的RNA的特殊构型。Ⅱ类内含子有一个保守的二级结构：结构域Ⅰ：两个保守内含子结构序列EBS1,EBS2与两个外显子结构序列IBS1,IBS2互相配对。结构域Ⅴ：高度保守，催化活性必需。结构域Ⅵ：A提供2‘-OH。

Ⅱ类内含子二级结构模式5’3’intronintronextron

第二类内含子的自我剪接包括以下几个步骤：内含子RNA折叠成有催化活性的结构；通过两步反应完成自我剪接（都是亲核取代反应）。

第一步:亲核基团A的2‘－OH对5’外显子和内含子交界处的磷酸二酯键进行亲和攻击；切下5’外显子。

第二步：释放出来的5’外显子上的3’－羟基亲核性地进攻内含子与3’外显子之间的磷酸基团，从而释放出内含子并将两个外显子连接起来。p2‘HO-Ap

p-Ap3’OHpP-AHO3’Ⅱ类内含子的剪接机制Mg2+套环的形成5‘3‘外显子连接核糖核酸酶P(ribonucleaseP，RNaseP)

核糖核酸酶P是一个核酸内切酶，它专门切除前体tRNA5’端的附加序列。

RNaseP是由RNA和蛋白质两部分组成的，其催化活性由其RNA部分产生，所以RNaseP本质上是一个核酶。随着物种的进化，RNaseP中蛋白质的含量逐渐增多，对催化的影响也逐渐增加。蛋白质成分的作用在RNaseP中不仅仅局限于稳定结构，而且也参与控制其催化作用。

RNaseP的催化机制需要金属离子。

RNaseP可剪切前体5‘端41nt,5’端成熟。不同tRNA的5’端没有顺序共同性，剪切的准确性与剪切部位周围的核苷酸顺序无关，表明在RNaseP的组分内没有引导序列，RNaseP所识别的是底物的高级结构。

RNaseP底物的二级结构剪切位点发卡核酶(hairpinribozyme)

发卡核酶与锤头核酶都属于植物病原性RNA。发卡核酶、锤头核酶以及动物病原性的D型肝炎病毒(hapetitisdeltavirus)都可以在没有蛋白质的情况下，在体外进行自我裂解反应。最为人们熟悉的发卡核酶存在于烟草环斑病毒卫星RNA(satelliteRNA)上。这种卫星RNA位于通过滚环原理(rolling—circlemechanism)进行复制的单链RNA上。当发夹核酶与底物结合时，其二级结构包括5个环和4个螺旋。核酶和底物组成螺旋1、2及对称的环1、5。剪切反应发生在底物识别序列GUC的5‘端。发夹核酶分别为2个结构域。结构域I由螺旋1、2和环1、5组成，结构域II由螺旋3、4和环2、3、4组成。腺苷酸残基A15连接两个结构域，使它们相互靠近相互作用，形成催化反应所必需的三级结构。环3被认为与催化作用无关。

发卡核酶在医药领域有广泛的应用前景。发卡核酶一个非常显著的特点是发卡核酶的保守序列之间可以嵌入蛋白质的结合部位。有实验表明，若在发卡核酶的双螺旋H4中嵌入一个噬菌体R17表面蛋白质的结合部位，修饰过的发卡核酶不但可以和噬菌体R17表面蛋白质结合，而且核酶的催化活性也得到增强。即使在没有蛋白质的情况下，保守序列之间嵌入蛋白质结合部位的发卡核酶的催化活性也增加了6～10倍。人工筛选的方法应该可以使修饰的核酶与大部分蛋白质结合。在发卡核酶序列间嵌入蛋白质结合部位的目的：通过蛋白质控制发卡核酶在细胞内的位置；设计双功能核酶；蛋白质可增加核酶的稳定性，而不被核酸酶降解；调控核酶在细胞内的活性，使核酶只在与特殊蛋白质结合的情况下才有活性。

由于癌细胞与正常细胞的区别往往是细胞胞浆中某一蛋白质表达的不同，因此在发卡核酶保守序列之间嵌入蛋白质的结合部位有望为治疗癌症开辟一条新的途径。锤头核酶(hammerheadribozyme)

锤头核酶也位于烟草环斑病毒(sTRSV)等植物病毒的卫星RNA上。锤头核酶是位于sTRSVRNA的正链上的一个仅有30个核苷酸的基序，它是最小的天然核酶。实验证明，锤头核酶基序除可以进行自我裂解之外，还可以裂解任何其他RNA分子。由于锤头核酶是最小的天然核酶，因此人们对其结构与反应机制的研究比对其他核酶要更加详尽。锤头结构的五种类型：R示酶，S示底物，箭头示剪切位点锤头型核酶的催化过程需要二价金属离子参与。单金属离子催化双金属离子催化

锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图三个双螺旋区13个核苷酸残基保守序列剪切反应在右上方GUX序列的3‘端自动发生

锤头核酶广泛应用于治疗疾病和临床检测人工筛选的锤头核酶可用于裂解较长的mRNA底物。裂解较长mRNA底物时，要加入一些非特性的单链RNA结合蛋白质，破坏mRNA底物的立体结构，使反应速率加快。底物结合臂的长短对裂解反应的快慢有很大的影响。适中长度可使锤头核酶有效地裂解底物又使产物快速地离开，此原则对于设计用于体内的锤头核酶尤为重要。环形RNA核酶(circularRNAribozyme)

环形RNA是一些内含子、外显子剪接过程中产生的独特的小RNA。目前已发现的天然环形RNA存在于植物、动物和酵母中。它们在细胞中可能的作用是为滚环复制提供模板。环形RNA之所以引起人们的重视，是因为它们的降解半衰期比线性的RNA长很多。从理论上讲，RNA环只要不被内切性核酸酶线性化，就一直可以不被外切核酸酶降解掉。实验数据也表明环型RNA在细胞萃取液中较线型RNA稳定很多。核酶能否成为医药产品取决于其在体内的降解半衰期的长短。

三、人工核酶

第一类内含子、第二类内含子以及RNaseP等都是存在于自然界中的天然核酶。科学家们现在可以利用现代生物技术在生物体(主要是微生物)内大量合成核酶，并筛选出不同于天然核酶的新核酶。这些筛选出的新核酶具有比天然核酶更高的催化活力，或能够催化天然核酶不能催化的反应。（一）核酶的人工合成与筛选

蛋白质有催化生化反应或支持细胞结构等生物功能，但蛋白质无法传递遗传信息。指导蛋白质合成的遗传信息是由核酸分子(DNA或RNA)传递的。而一般的核酸分子虽然可以传递遗传信息，但它们不能直接催化生化反应或对细胞结构起到支持作用。

核酶是一类特殊的核酸分子，它们既能传递遗传信息，又能直接催化生化反应。由于核酶的这一特性，人类可以在生物体外合成并筛选核酶。

通过固相合成核酸的方法在体外合成核酶。由于DNA的固相合成更加经济和有效率，因此可首先通过固相方法合成出一段DNA模板，然后用RNA聚合酶将DNA模板转录成RNA核酶。

体外合成和筛选核酶的目的是为了发现催化效率高于天然核酶的新核酶；或是找到一些新核酶，这些新核酶能催化天然核酶不能催化的反应。

体外筛选核酶的步骤：

第一步:在体外合成RNA用固相合成法合成大量随机序列的DNA分子，构建一个DNA文库。在利用RNA聚合酶将DNA转录成RNA。第二步:筛选目的核酶根据所需筛选核酶的生化特性，将符合要求的核酶从RNA文库中挑选出来。第三步:扩增

用PCR等现代分子生物学技术扩增这些被筛选出来的RNA。(二)核酶的化学修饰

增加核酶的活性与稳定性，增强核酶与底物之间的结合，缩短核酶识别底物所必需的序列。由于核苷酸的碱基、磷酸根和核糖部分都可以进行化学修饰，所以大分子核酶化学修饰的程度很难得到适当控制。

因此，大部分化学修饰核酶的方法只适用于小分子的、可以用化学方法合成的核酶，如锤头核酶和发卡核酶。几种常见的化学修饰方法：

DNA／RNA核酶法：

在用化学方法合成锤头核酶的过程中，以脱氧核苷酸代替两个底物结合臂上的核苷酸，而其余部分(包括催化核心)仍然是核苷酸链。DNA／RNA核酶具有难以被核酸酶降解、体内半衰期长的优点。另外，DNA／RNA核酶的催化活性也比天然核酶高3倍以上。RNA／2’－O－甲基核苷酸核酶法：

若用2’－0－甲基核苷酸取代锤头核酶两个底物结合臂上的核苷酸，核酶的稳定性也将增加。实验结果表明，RNA／2’一0一甲基核苷酸核酶在人类血液中的半衰期达到72h，完全适用于治疗用途。另外，RNA／2’一0一甲基核苷酸核酶的催化活性也高于天然核酶。修饰锤头核酶的双螺旋Ⅱ及突环Ⅱ

将锤头核酶的双螺旋Ⅱ去除，反应活性会增加30％。将RNA／DNA锤头核酶的突环Ⅱ缩短成只有5个胸腺嘧啶，或以非核苷酸的结构（如丙二醇）代替突环Ⅱ，锤头核酶的活性亦有所增强，更有效地结合并裂解目标底物。在保持或增加催化活性的同时被去除了不必要结构的核酶，被称为迷你核酶(minizyrne)。以上几种双螺旋Ⅱ或突环Ⅱ被修饰了的锤头核酶就是迷你核酶。2’－F－脱氧核苷酸和2’－氨基－脱氧核苷酸核酶法

在合成核酶时，掺入2’－F－脱氧核苷酸和2’－氨基－脱氧核苷酸，可增强反应活性，并且可使核酶在人的血液中的稳定性提高近1000倍。除了几个特定位点的核苷酸不能被替换以外，核酶中的大部分核苷酸都可被脱氧核糖核苷酸的类似物如2’－F－脱氧核苷酸或2’－氨基－脱氧核苷酸代替，而不影响核酶的整体结构。四、核酶在医药领域的应用(一)核酶治疗疾病的原理

核酶作为药物用于治疗癌症和病毒性感染是一个很有发展前途的领域。用核酶药物治疗疾病的原理是：

核酶可以选择性地裂解癌细胞与病毒的RNA，从而阻断它们合成蛋白质。以艾滋病的治疗为例，可以针对HIV的RNA序列和结构，设计出专门裂解HIV病毒的RNA的核酶，而这种核酶对正常细胞RNA没有影响。

核酶及反义RNA都可以作为药物用于治疗癌症和病毒感染。它们的序列专一性都很高，都对与同它结合的靶向RNA具有高度的选择性。由于核酶是催化性分子，一个核酶分子可以裂解与之结合的靶向RNA，将其释放，然后再裂解其它靶向RNA;而一个反义RNA分子只能“自杀性”地阻止一个RNA分子发挥生物活性。

与反义RNA相比，核酶药物具有治疗剂量小的优点。即：核酶药物的毒性比反义RNA药物毒性小。此外，病毒基因组的变异快，所以，病毒对大部分针对单一靶向的治疗方法会很快产生耐药性；而将多种针对不同RNA靶向序列的核酶同时用于抑制病毒RNA，病毒则较难产生耐受性。

(二)核酶的给药途径用核酶药物治疗疾病，必须考虑如何将具有催化活性的核酶运送到靶向细胞内的问题。

用于疾病治疗的核酶需满足以下几个条件：能够被完整地运送到靶向器官或靶向细胞内；在靶向器官或靶向细胞内仍保持很高的活性和稳定性；在短时间内裂解靶向RNA，这个时间短于靶向RNA的自然半衰期。1、外源性给药方式直接将抗核酸酶降解的核酶注射到组织或细胞里。优点：方便、见效快。缺点：核酶在组织或细胞里极不稳定，需多次补充核酶以维持核酶的浓度和功效；核酶吸收较差，越大的核酶越难吸收；体液中含大量的核糖核酸酶，核酶易在运送过程中降解。

发卡核酶、锤头核酶基序较小，对底物要求较低，是各类核酶中较适合于外源性给药方式的核酶。2．内源性给药方式

利用基因疗法运送核酶的最大优点是核酶可在细胞或组织内稳定地表达。逆转录病毒运载体和腺伴随病毒运载体都可用于运载核酶。

选用何种病毒运载体，都需考虑以下两个因素：核酶载体是否能有效地将核酶运送到靶向细胞或靶向组织；核酶在靶向细胞或靶向组织内的表达是否能符合治疗的要求。

用逆转录病毒运载体运送核酶是目前最有前途的内源性核酶给药方法。

这些运载体可通过RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ催化的反应表达核酶。RNA聚合酶Ⅱ启动因子具有组织专一性，因此核酶可选择性地在特定的组织中表达。而用RNA聚合酶Ⅲ催化反应时，核酶的表达则很高。逆转录病毒运载体的一个特点是：它只能运送核酶进入可分裂的细胞。这对于治疗被病毒感染的，分裂很慢或不分裂的细胞是不利的；但这对于把核酶导人快速分裂的癌细胞却是一大优势。腺伴随病毒的优点：

它可运送核酶进入不分裂的细胞。但是，40％--80％的成年人对腺伴随病毒有免疫反应。

在细胞内表达的核酶同样会被核酸酶降解。提高这些核酶细胞内稳定性的方法包括：将核酶环化；将核酶嵌人tRNA中；在3’一末端加入一个稳定的发卡结构等。（三）核酶在医学上的应用1、核酶抗肝炎病毒的研究目前人们已进行了核酶抗甲肝、乙肝、丙肝等病毒的研究。人工设计核酶多为锤头状结构，少数是采用发夹状核酶。2、抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-Ⅰ)核酶1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶抑制HIV-Ⅰ基因表达，并率先进入临床Ⅰ期。3、抗肿瘤治疗

核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。五、核酶技术面临的问题1、核酶催化切割反应的可逆性问题；2、提高催化效率；3、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞；4、使核酶在细胞内有调控地高效表达；5、增强核酶在细胞内的稳定性；6、对宿主的损伤问题有待进一步考察。六、展望

核酶技术作为一种很有希望的基因治疗手段,尽管还有许多上述问题有待解决,但20年来已取得巨大的发展。上述问题的解决,无疑将使核酶应用于临床的时间进一步缩短。虽然核酶抗病毒、抗肿瘤作用目前多处于实验研究阶段,但已经露出了希望的曙光。

随着全球科技工作者的进一步努力,核酶抗病毒、抗肿瘤的治疗一定会有光辉的前景。第二节脱氧核酶一、概述长期以来,DNA一直被认为是一种较为被动的分子,仅仅充当了遗传信息的载体,并起复制、转录遗传信息的功能。Cech等在1987年首次发现了RNA具有酶的催化效应,称为核酶。对核酶的结构及应用研究逐步深入,揭示了其特异性催化机制。这一发现突破了“酶都是蛋白质”的传统概念,使人们开始对遗传物质DNA有了新的认识。

随着分子生物学和体外分子进化技术的发展,一些实验室发现单链DNA分子同样具有酶活性,这些具有催化功能的DNA分子称为脱氧核酶(DNAzyme),又称酶性DNA,在一定条件下可切割RNA分子特定位点内部的磷酸二酯键。

脱氧核酶的发现进一步延伸了酶的概念。

自1994年首次发现脱氧核酶以来,迄今已发现了几十种脱氧核酶。根据其功能可分为7大类:具有RNA切割活性;具有DNA连接酶活性;具有卟啉金属化酶和过氧化酶活性;具有DNA水解活性;具有DNA激酶活性;具有N2糖基化酶活性;具有DNA戴帽活性。

其中最特别的是具有RNA切割活性的脱氧核酶,它能催化RNA特定部位的切割反应,从mRNA水平对基因灭活,从而调控蛋白质的表达,可能成为对抗病毒感染、肿瘤等疾病的新型基因治疗药物和基因功能研究、核酸突变分析等的新型核酸工具酶。

1、具有RNA切割活性的脱氧核酶的结构与特性

Santoro等从包含约1014个随机DNA文库中筛选出两条高效、通用的脱氧核酶:10-23型DNAzyme(10-23DRz)8-17型DNAzyme(8-17DRz)10-23DRz是第10轮扩增第23个克隆,由15个脱氧核糖核苷酸构成一个环状催化中心,两侧臂各有8个脱氧核糖核苷酸构成酶分子的底物识别部位,其碱基序列与底物通过碱基配对的形式紧密结合。底物识别部位的特殊序列构成提供了特异性底物结合信息,能把DNAzyme的催化性碱基环固定到RNA底物分子上。10-23型脱氧核酶作用机理RYRRNAsubstrate切割点R=AorGY=CorUdeoxyribozyme5

3

10-23DRz的切割位点位于RNA分子上的未配对的嘌呤(A)和配对的嘧啶(U)之间,切割RNA后可产生(3′)-环磷酸和5′-羟基未端的切割产物。通过合理设计DNA酶底物识别部位的核苷酸序列,就能对任何含有嘌呤、嘧啶的RNA分子进行切割。8-17DRz中带有不配对的“wobble”成分,即位于切割点相邻处的rG－dT非配对碱基。8-17DRz要求的切割位点为AG连接,因此在RNA灭活研究中,10-23DRz更灵活,应用更广。

脱氧核酶最主要的特性:高效催化性高度专一性(由碱基配对所决定),稳定性好分子量小价格便宜等容易合成切割位点选择的限制更少

通过合理设计DNAzyme底物识别部位的核苷酸序列,就能对任何含有嘌呤、嘧啶的RNA分子进行靶向切割,从而调控蛋白质的表达。2、具有RNA切割活性的脱氧核酶的应用脱氧核酶将高效的催化降解能力与反义的靶向识别能力结合,使得其应用从基础生物技术领域扩展到医疗领域,在序列特异性RNA降解方面具有广阔的应用前景,在生物体外可以作为RNA的限制性内切酶,在体内可在mRNA水平上关闭基因表达。

3、问题与展望作为一种新型的治疗药物,与核酶、反义核酸、寡核苷酸等一样,应用脱氧核酶进行基因治疗,最主要的问题是如何提高其在体内的稳定性,如何有效的进入靶细胞,以及其在体内活性的监测及可控性等。

为了提高其在体内的稳定性和靶向性,许多学者尝试对脱氧核酶进行修饰。

Unwalla等利用G-残基能直接与巨噬细胞的清道夫受体相互作用的能力,合成一种脱氧核酶DNAzyme5970,在3-端含有10个G残基,催化核心区为10-23DRz的催化区,为了提高其稳定性,在其识别臂分别加上2条12个碱基组成的茎-环结构。在缺乏脂质体载体时,该DNAzyme能特异地与人巨噬细胞特异性细胞系作用而切割靶mRNA。

Vester等将2个α-L-LNA或LNA(Lockednucleicacid)引入10-23DRz的2个识别臂中而合成了LNAzyme。与未修饰的DNAzyme相比,LNAzyme活性显著升高,且能对天然的含有高级结构的rRNA进行靶向切割。

Dass等研究表明3’倒转修饰能显著提高其在体内的稳定性,在人血清(浆)中半衰期达22h,而未修饰的DNAzyme的半衰期仅为70min,且其不影响其细胞摄取和催化活性。Okumoto等研究表明催化核心区第9位C磷酸化可使其催化效率提高近10倍。4、结语DNAzyme是一崭新的分子生物学酶切工具；生物催化剂领域的新成员；DNAzyme具有分子量小、稳定性高、特异性强、高效催化性以及价格便宜、容易获得等优点。设计不同的DNAzyme可以切割任何mRNA的启动子序列AUG,从而调控蛋白质的表达。

作为一种新型RNA水平强效基因灭活因子,DNAzyme为治疗RNA病毒感染性疾病、肿瘤和心血管疾病提供了一条全新的途径。

第三节抗体酶（Abzyme)

抗体酶自1986年研制成功以来，在生物学、化学、医学、制药等诸多学科中发挥着重要的作用，它开创了催化剂研究和生产的崭新领域。

抗体酶的研究深化了对酶本质的认识，丰富