蛋白质组学技术服务(张立岩)

蛋白质组学研究技术服务

张立iozhangliyan@126.comMainContent蛋白质组学研究蛋白质N-末端测序质谱分析1.20世纪中后期，生命科学研究进入了分子生物学时代。2.随着人类基因组全序列测定，生命科学跨入了后基因组时代。

mRNA的表达情况不能直接反应蛋白质的表达水平蛋白质动态修饰、加工、转运定位、结构形成、代谢等，均无法从基因组水平上的研究获知蛋白质构象病更难于只靠DNA序列来解释3.蛋白质才能动态反映生物系统所处的状态。

20世纪90年代中期，国际上萌发了蛋白质组学。产生背景蛋白质组学概念是一个基因组所表达的所有蛋白质(动态)基因组学(结构)蛋白质组学(功能)澳大利亚Macquarie大学的Wasinger和Williams等于1995年在意大利的锡耶纳(Siena)召开的双向电泳会议上首次提出转录、表达、加工、修饰、运输（时空）蛋白质组学(proteomics):

整体性:分析细胞内全部蛋白质组成成份动态性:表达水平与修饰状态

(不同细胞、组织、生理条件和发育阶段)

系统性:蛋白质之间的相互作用

揭示生物学行为(疾病过程和药物效应)基因表达调控机制蛋白质组学内容表达研究:SAGE和基因芯片.拼接和修饰(mRNA)

功能研究

:1/3序列功能未知

修饰研究:磷酸化和糖基化等翻译后修饰(信号诱导)

定位和区域化:亚细胞定位提供蛋白调控新机制蛋白质间相互作用:表达调控蛋白质组学应用领域1：蛋白质分离和纯化

1DESDS电泳(分子量)2DE

等电聚焦电泳(等电点)SDS电泳(分子量)

激光捕获显微切割（LMD）

技术平台考马斯亮兰染色银染荧光染色

从组织切片中将不同类型的细胞精确分离蛋白质分离

1-DE:

分子量

2-DE:

等电点分子量等电点（pI)IPG胶条2DE分子量SDS－PAGE2DE质谱技术(massspectrometry,MS)

MALDI-TOF-MS技术

ESI-MS技术

MS/MS技术技术平台

N-末端测序

Edman降解法2:蛋白质结构的鉴定3:数据库分析鉴定蛋白质技术路线蛋白质N-末端测序PITC：异硫氰酸苯酯,偶联剂PTC肽：苯氨基硫甲酰肽H＋：无水强酸TFA，三氟乙酸PTC氨基酸：2－苯胺基噻唑啉酮氨酸PTH氨基酸：乙内酰基苯硫脲氨酸几个概念基本原理Edman化学降解法苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物三甲胺水溶液Edman化学降解法三氟乙酸氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物Edman化学降解法HPLC分离鉴定稳定的苯乙内酰硫脲（PTH）衍生物标准PTH氨基酸蛋白质N末端测序报告形式标准PTH氨基酸第一个氨基酸第二个氨基酸第三个氨基酸蛋白质N末端测序报告形式Edman降解的最大优越性是在水解除去末端标记的氨基酸残基时，不会破坏余下的多肽链应用领域蛋白质的鉴定(科研)基因工程多肽药物申报(新药开发)ABI492cLC型蛋白测序仪反应效率高:该仪器拥有专用于PVDF膜测序的特制反应室，使其测序条件得到进一步的优化，可使反应效率达到98％以上。灵敏度高:利用毛细管进样和细径的HPLC柱对PTH氨基酸进行分离，可测定浓度低至fmol的蛋白，实现“可见即可测”的梦想。准确:因为可直接利用PVDF膜上的样品进行测序，相当于获得了PAGE纯化的样品，解决了杂质对蛋白质测序的干扰问题，可获得准确的肽段序列。ABI492cLC型蛋白测序仪优势:蛋白质N末端测序劣处蛋白质N端封闭

乙酰基,甲酰基或焦谷氨酰基团等氨基酸修饰质谱分析质谱分析原理通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(Ｍ/Ｚ值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的Ｍ/Ｚ值，分析鉴定未知蛋白质。软性离子化电喷雾离子化(ESI)

基质辅助激光解吸离子化(MALDI)将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。MALDI-TOF-MS工作原理机械构造MALDI-TOF-MS工作原理LaserMatrix&sample+++++升华TOF(TimeofFlight):无电场飞行管的飞行时间DetectorIonSource20-25kV时间飞行质谱检测原理TOF(TimeofFlight):飞行时间.带单电荷的不同大小分子量的多肽片段同时激发FlightTube:

无电场飞行管Detector多肽片段分离:小分子量多肽片段飞行速度高,飞行时间短大分子量多肽片段飞行速度慢,飞行时间长时间飞行质谱检测原理IonSou