第5章-中药制剂中各类化学成分分析

第五章中药制剂中各类化学成分分析

本章重点：1、掌握中药制剂中生物碱、黄酮、三萜皂苷、醌类成分的定性、定量原理与方法。2、熟悉中药制剂中挥发性成分的定性、定量原理与方法。第一节生物碱类成分分析一、概述：1、生物碱：是指来源于生物界（主要是植物界）的一类含氮有机化合物。大多数有较复杂的环状结构，氮原子结合在环内；因结构中有未共用电子对而多数具有碱性，可以和酸成盐；大都具有特殊而显著的生理活性。2、生物体内普遍存在的含氮有机化合物，氨基酸、蛋白质、核酸及某些含氮维生素除外。3、植物里存在的生物碱的含量差别较大，但生物碱大多有明显的生理活性，故常用该成分作定性定量依据。在植物体中，生物碱往往和有机酸结合成盐的形式存在。4、含生物碱的中药多分布在防己科、罂粟科、毛茛科、豆科、小檗科等双子叶植物中，具体药材和相应成分见书P96～97.二、结构特征及理化性质：（一）结构特征：生物碱大多由C、H、N、O元素组成，结构复杂，种类多。通常根据氮杂环的结构特点不同将生物碱分为多种结构类型，常见的有吡咯类、蒎啶类、吲哚里西啶类、莨菪烷类、喹啉类、异喹啉类、吲哚类等。吡咯蒎啶吲哚里西啶莨菪烷喹啉异喹啉吲哚（二）理化性质：1、物理性状：多数为无色或白色结晶性固体，小分子生物碱有挥发性。个别具有升华性。有的有荧光，多数味苦。2、旋光性：大多数生物碱有旋光性，多呈左旋。旋光性与生理活动密切相关。一般左旋体生理活性强。3、溶解性：①大多数生物碱难溶于水，易溶于苯、乙醚、氯仿等亲脂性有机溶剂。②与酸结合生成盐后水溶性增加，但在水中的溶解度有差异。一般无机酸盐的水溶性大于有机酸盐；无机酸盐中含氧酸盐的溶解度大于卤代酸盐。小分子有机酸盐大于大分子有机酸盐。③季铵型生物碱、具有半极性的N、O配位键的生物碱、酰胺碱易溶于水。④某些小分子或液体生物碱既可溶于水也可溶于亲脂性有机溶剂。⑤含有酸性官能团或酯键的生物碱还可溶于一些碱液或热苛性碱液。4、沉淀反应：①大多数生物碱在酸性水溶液中可以与某些试剂生成不溶于水的复盐或分子复合物。

沉淀试剂多为分子量较大的碘化物复盐，重金属盐，大分子酸类等。常用的有：碘化铋钾、碘-碘化钾等。②注意假阳性的干扰。它们是酸水浸出液中的蛋白质、多肽、鞣质。所以进行沉淀反应前，要净化。5、显色反应：①生物碱在一定pH条件下可与一些酸性染料生成有色络合物，可被氯仿等有机溶剂定量提出。②结构中含有酯键的生物碱可与异羟肟酸铁试剂反应产生紫红色。6、碱性：①氮原子的杂化方式（最主要因素）SP3>SP2>SP；②碱性集团：胍基>季铵碱>N-烷杂环>脂肪胺>芳胺类（芳杂环）>酰胺7、紫外光谱特征：①结构中有共轭体系的生物碱均有紫外吸收。②结构中的氮原子与发色团直接连接或参与发色团的生物碱，其吸收峰位置与测定时溶剂的pH值有关。三、定性鉴别：（一）一般理化鉴别：主要应用生物碱沉淀反应(1)生物碱的酸性水溶液或稀醇溶液中，滴加硅钨酸生成淡黄色或灰白色沉淀。(2)生物碱的酸性水溶液或稀醇溶液中，滴加碘-碘化钾试剂数滴，产生棕色或褐色沉淀。

BH++I2-K+I-→BI2HI（棕、褐色）+K+(3)生物碱的酸性水溶液或稀醇溶液中，滴加碘化铋钾、碘化汞钾试剂数滴，产生红棕色沉淀、类白色沉淀。

BH++BiI3KI→BBiI3HI（红棕色）+K+BH++HgI2KI→BHgI22HI（类白色）+K+

（4）生物碱的水溶液在中性条件下加苦味酸生成黄色沉淀。（5）雷氏铵盐与季铵碱生成红色沉淀。（6）酸水浸出液中的蛋白质、多肽、鞣质等也可以与沉淀试剂发生反应，造成假阳性结果。所以进行沉淀反应前，要净化除去干扰成分。（7）中药制剂中有两种以上中药含有生物碱成分，沉淀反应定性鉴别就难以说明问题。（二）色谱鉴别：1、薄层色谱法：首先用适当的溶剂提取生物碱，提取液经浓缩后直接或经过必要的净化后，点在薄层板上，层析后喷洒生物碱显色剂，再根据生物碱的特性，选择特异的颜色反应或荧光波长进行观察，并应用纯品对照或标准药材对照，有时须作阴性对照后才能确定成分。①吸附剂：硅胶、氧化铝。②展开剂：多用氯仿、苯等低极性溶剂，可加入其他溶剂调整展开剂的极性。③因硅胶显弱酸性，强碱性的生物碱在硅胶板上成盐，易形成复斑，故用硅胶为吸附剂时，一般应用碱性系统展开剂或使薄层分离在碱性环境下进行。④显色剂：常用改良碘化铋钾试剂，有时喷碘化铋钾之后再喷硝酸钠试剂，可使样本斑点更加清晰。⑤也可用碘蒸气，硫酸铈等试剂显色。

2、纸色谱法：①可用于生物碱盐或游离碱的鉴别。②主要是以水为固定相的正相纸色谱法，分离效果常取决于流动相的性质。③利用纸色谱来快速鉴别乌头中双酯类生物碱和醇胺类生物碱有其独到之处。④所用显色剂基本和薄层色谱法相同，但含硫酸的试剂不适用。

3、高效液相色谱法：①适合结构十分相似的生物碱的鉴别。②在恒定的高效液相色谱条件下，各种生物碱都具有一定的保留时间，保留时间可作为定性鉴别的参数。用供试品与对照品相应的保留时间进行比较来鉴别。③若色谱条件不能恒定，将已知对照品加入供试品中，利用峰面积或峰高加大法进行检识。④为保护色谱柱，供试品要经滤膜过滤后再进样，色谱柱前也要使用保护柱。4、气相色谱法：适用于具挥发性且加热不分解的生物碱的分离和鉴定。四、含量测定：（一）总生物碱含量测定：1、化学反应法：使用此法，要求样品供试液中总生物碱成分纯度高。常用于处方药味少，内含成分简单的制剂。包括重量分析法和容量分析法（滴定分析法），其中酸碱滴定法最常用。酸碱滴定法：①游离生物碱不溶于水，可先将生物碱溶于过量标准酸溶液中，再用标准碱溶液回滴。②生物碱盐在水或乙醇介质中用强碱溶液滴定。一般使其溶于90％乙醇溶液中（因在70%～90%乙醇介质中终点比在水中明显），可用标准碱乙醇液滴定，用酚酞作指示剂。③若选择的溶剂及指示终点方法合适，还可用非水滴定法。

2、分光光度法：多采用单波长光度法测定中药制剂中总生物碱成分的含量。测定波长可以是被测生物碱本身的吸收波长，也可是加入试剂显色后的波长。供试品要经过分离净化才可测定。(1)直接测定：①原理：不经过化学反应，利用生物碱自身的光吸收直接进行分光光度法测定的方法。②特点：不加试剂。③适用范围：一般用于药味较少、干扰不大的中药制剂中总生物碱的含量测定。注意溶液中有其他有色物质或有紫外吸收、荧光吸收的物质时要先排除。（2）离子对萃取比色法：用于中药制剂中微量生物碱类成分的含量测定。原理：生物碱在一定pH介质中，与一些试剂定量地结合为有色离子对，此离子对可定量转溶于某些有机溶剂，然后在一定波长下测定有机溶剂的吸收度，即可按分光光度法计算生物碱的含量。常用做离子对配位体的酸性染料有甲基橙、溴麝香草酚蓝（BTB）等.酚类和羧酸类有苦味酸、苯甲酸等。无机离子有Cl-﹑Br-等。①酸性染料比色法：特点：在一定pH介质中，生物碱盐阳离子与一些酸性染料阴离子定量地结合为有色离子对，此离子对可定量溶于某些有机溶剂，然后在一定波长下测定此有机溶剂的吸收度，即可按分光光度法计算生物碱的含量。BH++In-(BH+In-)BH+·In-注意事项：a选择适宜的pH值是本法关键之一：pH值低生物碱呈阳离子而酸性染料为游离状态。pH值高则酸性染料呈阴离子但生物碱为游离状态。两情况阴阳离子均不能定量结合。pH值的选择根据染料性质和生物碱碱性确定。b选择适宜的有机溶剂是本法关键之二：要求对离子对溶解度好且无水，常用氯仿、二氯甲烷等。c选择适宜的酸性染料是本法关键之三：最好用溴麝香草酚蓝（BTB）。d应防止操作时混入水分。有机溶剂提取液可加入脱水剂（如无水硫酸钠）或经滤纸滤过除去微量水分。②雷氏盐比色法：特点：雷氏盐(NH4〔Cr(NH3)2(SCN)4〕·H2O)在酸性介质中可与生物碱类成分定量地生成难溶于水的生物碱雷氏盐沉淀，此沉淀易溶于丙酮，其丙酮溶液所呈现的吸收特征，是由于分子结构中的硫氰酸铬铵部分，而不是结合的生物碱部分，其吸收值与生物碱样品本身或溶剂无关。因此，有两种方法计算样品中生物碱的含量：a将沉淀分离洗净，溶于丙酮（或甲醇），于520～526nm（溶于甲醇，λmax为427nm）波长处用分光光度仪测定吸收度，换算生物碱的含量。雷氏盐在丙酮中的摩尔吸收系数为106.5(单盐，即雷氏盐与1分子生物碱结合生成的盐)或213.0(双盐)。故可根据其吸收值A按下式直接计算样品量而不需绘制标准曲线。

W=（A/ε）×M×V式中，W：生物碱雷氏盐沉淀的重量（mg）；M：生物碱雷氏盐沉淀的分子量;A：吸收度；ε：硫氰酸铬铵摩尔吸收系数；V：丙酮液毫升数。本方法不需要标准品，但需注意生物碱雷氏盐沉淀是生成单盐还是双盐，并要注意样品的净化。b也可以精密加入过量雷氏盐试剂，滤除生成的生物碱雷氏盐沉淀，之后用分光光度法测定滤液中过量雷氏盐的含量，间接计算生物碱的含量。注意事项：A雷氏盐使用前新鲜配制，沉淀反应需在低温下进行。B供试品为稀的水溶液，沉淀前应浓缩。溶液中有干扰物质时，应事先经过纯化处理。C雷氏盐的丙酮或丙酮-水溶液的吸收值随时间而变化，故应尽快测定。③异羟肟酸铁反应：特点：含酯键的生物碱在碱性介质中加热，酯键水解后产生的羧基与羟胺反应生成异羟肟酸，异羟肟酸再与Fe3+生成紫红色的异羟肟酸铁，在一定浓度符合郎伯比尔定律，可用分光光度法进行含量测定。注意事项：适用于含酯键的生物碱的含量测定，但供试品溶液中不能含有其他酯类或羧酸类成分。（二）单体生物碱含量测定：多用色谱法。1、薄层色谱（扫描）法：薄层色谱技术对生物碱类成分分离和测定需要结合生物碱的特性提取和纯化，后使用碱性展开剂或在碱性环境中展开。在薄层扫描定量时，须首先作一工作曲线，目的是考察工作曲线是否通过原点，其次需要找出线性范围，以便摸索样品点样量。此外薄层扫描定量还需要采用随行点样法，以便尽量减小误差.注意：①选用吸附剂、展开剂及显色方法与薄层鉴别相似，但更严格。②显色剂常用改良碘化铋钾，挥干展开剂后喷洒，显色要均匀.2、高效液相色谱法：生物碱类成分进行高效液相色谱分析时，可采用正相、反相和离子对色谱，其中以反相高效液相色谱应用较多。在反相高效液相色谱中为了克服游离硅醇基的影响，采取了以下的措施：(1)流动相方面的改进：

A、加入硅醇基抑制剂，最常用的硅醇基抑制剂是三乙胺;B、在流动相中加入离子对试剂,掩蔽生物碱类成分的碱性基团;C、在流动相中加入季铵盐试剂，例如在水-甲醇流动相中加入0.01mol／L的溴化四甲基胺。

(2)固定相方面的改进：选择碳链较短的键合相硅胶填料，例如用C8比C18好。含量测定操作基本流程：样品供试液制备：样品根据生物碱通性提取、净化、定容制备供试液。标准液配制：先配成标准储备液，再配制成系列标准液。测试条件选择：色谱柱（多用C18）、流动相(多用甲醇-水或乙腈-水)、流速（多用1ml/min）、检测器(多用紫外检测器)、测试波长（多为被测物最大吸收波长）。选择定量方式，之后进样、检测、计算含量。3、气相色谱法：气相色谱法适用于有挥发性的，遇热不分解的单体生物碱的含量测定。第二节黄酮类成分分析一、概述：1、黄酮：以前黄酮类化合物主要是指基本母核为2-苯基色原酮类的化合物，现在则是泛指两个苯环（A与B环）通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物。是一类重要的天然色素，也是中药中一类重要的有效成分。2、黄酮类化合物分布广泛，多分布于高等植物中，集中在被子植物。以唇形科、玄参科、爵麻科、菊科等存在较多。常以游离态或与糖结合成苷的形式存在。在花、叶、果中多为苷；在木质部多为苷元。含黄酮类成分的常用中药见书P106。3、生理活性：多种多样，作用不强，毒性不大。①心血管方面作用②镇咳、祛痰③保肝④抗菌、抗病毒⑤其它：泻下、解痉、抗癌、抑制爱滋病毒等二、结构特征及理化性质：（一）结构特征：依据C环的成环、氧化和取代方式的差异，将重要的天然黄酮类化合物苷元结构分类如下：1、黄酮和黄酮醇2、二氢黄酮和二氢黄酮醇：黄酮的2、3位双键被饱和3、异黄酮和二氢异黄酮：由2-苯基变为3-苯基取代4、查尔酮和二氢查尔酮：可以转化5、橙酮：橙酮C环为五元环结构。6、花色素类和黄烷醇类：无羰基。另外大多数黄酮类化合物可结合成苷，苷中的糖分类有一糖：葡萄糖、鼠李糖等；二糖：槐糖、龙胆二糖、芸香糖、新橙皮糖等三糖：龙胆三糖等（二）理化性质：1、性状：苷元为结晶性固体，苷为无定形粉末。2、溶解性：①游离苷元易溶于甲、乙醇，乙酸乙酯，乙醚及稀碱液中，不溶或难溶于水。游离苷元的母核上引入羟基，水溶性增加，且水溶性与羟基数目成正比，羟基甲基化，脂溶性增加，水溶性降低。②黄酮苷类易溶于热水，甲醇，乙醇。难溶或不溶于亲脂性有机溶剂，一般多糖苷在水中的溶解度大于单糖苷。3、酸碱性：①黄酮类化合物分子中具有酚羟基，故显酸性。②黄酮类化合物因为分子中的γ-吡喃酮环上的1-氧原子有未共用电子对，可接受质子而显弱碱性，与强酸结合生成钅羊（yang）盐，其极不稳定，可加水分解。不同类型的黄酮溶于浓硫酸时，常表现出不同的颜色，可用于鉴别。4、显色反应：与分子中的酚羟基及γ-吡喃酮环有关。①还原反应：a盐酸-镁粉反应：将样品的甲醇或乙醇液，加入少许镁粉振摇，再滴加几滴浓盐酸，即可。现象：泡沫处呈红色。应用：黄酮，黄酮醇，二氢黄酮（醇）b四氢硼钠反应:样品的甲醇液，加等量2%NaBH4的甲醇液，加浓盐酸或硫酸，即可。现象：溶液生成紫色或紫红色应用：二氢黄酮类专属反应②与金属盐类试剂的络合反应:分子中具有3-羟基，4-羰基或5-羟基，4-羰基或邻二酚羟基的黄酮有此反应.a三氯化铝显色:样品的乙醇溶液加三氯化铝乙醇溶液显鲜黄色荧光。（含4’-OH或7，4’-OH显天蓝色荧光）b锆盐-枸橼酸反应:样品的甲醇液加2%ZrOCl2/MeOH,生成黄色锆络合物，说明有3-OH或5-OH。加2%枸橼酸，仍呈鲜黄色说明有3-OH，黄色溶液显著褪去，无3-OH有5-OH。c醋酸镁显色:纸片上滴加样品液，喷醋酸镁甲醇液，加热干燥，UV观察。现象：二氢黄酮（醇），天蓝色荧光。黄酮、黄酮醇、异黄酮，显黄-橙黄-褐色荧光.5、紫外光谱特征：①黄酮类化合物具有2-苯基色原酮基本母核而具有特定吸收峰，常有两个较强的吸收带。②I带(300-400nm)→B环桂皮酰基③II带(240-285nm)→A环苯甲酰基④黄酮类化合物中加入一些位移试剂如甲醇钠、醋酸钠、三氯化铝等，可使最大吸收波长发生位移，选择性提高，还可消除杂质干扰，有利于含量测定。三、定性鉴别：（一）显色反应：1、盐酸-镁粉反应：操作：将中药制剂用适当方法提取分离，制成供试品溶液。常用的提取溶剂有甲醇、乙醇或乙酸乙酯等；取样品液5～10mL，先加入少许镁粉，然后加入数滴盐酸，如果有黄酮、黄酮醇或其二氢化合物存在，数分钟后则可产生红色或紫红色。注意：①为避免供试品溶液本身颜色的干扰，可观察泡沫颜色，泡沫为红色，示阳性。②查耳酮、橙酮等单纯在浓盐酸作用下也会发生颜色变化，须做空白对照。即不加镁粉只加浓盐酸观察，产生红色即表明溶液中有上述成分。2、与金属盐类试剂的络合反应：黄酮类成分能与金属离子如Al3+，Zr4+等产生络合作用，产生荧光或颜色加深等。

络合作用的条件是黄酮类成分必须具备下述条件之一，即5-羟基(a)、3-羟基(b)或邻二酚羟基(c)，(a)、(b)都是羟基与4位羰基共同与金属离子形成络合物。

（二）薄层色谱法：黄酮类成分最常用的定性分析方法。一般采用吸附薄层，常用的吸附剂有硅胶与聚酰胺，也可用纤维素、硅酸镁等。

硅胶色谱分离弱极性化合物较好聚酰胺色谱分离含游离酚羟基的黄酮及其苷较理想纤维素薄层则适用于分离多糖苷混合物展开后的显色反应可采用在紫外光下观察荧光和喷显色剂相配合的方法。操作步骤：供试液制备、对照液制备、准备薄层板、点样、准备展开剂、展开、显色、色谱识别。1、硅胶薄层色谱：用硅胶分离黄酮成分，遵循正相色谱层析规律，化合物极性越强，所需溶剂的极性越大。其Rf值顺序如下：RCH3>RH>ROCH3>R-O-糖>ROH常用的展开溶剂系统有：

甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)，分离黄酮甙元；

苯-甲醇(95∶5)，分离黄酮甙元；苯-甲醇-乙酸(35∶5∶5)，分离黄酮甙；氯仿-甲醇(8∶2)，分离黄酮甙元及甙；

苯-乙酸乙酯(7.5∶2.5)或苯-丙酮(9∶1)，分离黄酮甙元衍生物如甲醚或乙酸酯中性成分；甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)，分离双黄酮成分。

展开剂系统中各组分的配比可根据薄层色谱的需要加以调整。2．聚酰胺薄层色谱：聚酰胺薄层色谱用于分离含游离酚羟基的黄酮甙与甙元较好。由于各种黄酮类成分取代基团的性质、多少和位置的不同，与聚酰胺形成氢键的能力有所差异而得到分离（酚羟基越多Rf

越小）。一般说来，聚酰胺薄层色谱展开剂中大多含醇、酸、水。常用的溶剂系统有：甲醇-水(8∶2)，分离黄酮甙元及甙，苯-丁酮-甲醇(6∶2∶2)，分离黄酮甙元；乙酸-水(1∶2)，分离黄酮甙。3、纤维素薄层色谱：纤维素薄层色谱可用于分离黄酮甙类(尤其是多糖苷)，原理与纸色谱相同，常用的展开剂为正丁醇-乙酸-水(4∶1∶5)的上层溶液。注意：黄酮类成分的纤维素色谱行为是分子中酚羟基增多时，Rf值减少；当分子中羟基为甲基或甲氧基所取代时，Rf值增加。四、含量测定：（一）总黄酮含量测定：用分光光度法1、直接测定法：利用黄酮类自身的光吸收，直接以最大吸收波长测定其吸收度，以芦丁等为对照品计算含量。多用标准曲线法。注意事项：①一般用于药味较少，干扰不大的中药制剂中总黄酮类化合物的含量测定。②λmax黄酮醇:285～358nm;黄酮:304～350nm;二氢黄酮（醇）：270～295nm；异黄酮：245～270nm；查耳酮：340～390nm。2、加试剂显色测定法：利用黄酮类化合物与金属盐类试剂的络合反应来显色测定。最常用的是与铝盐反应显色，试剂为三氯化铝或硝酸铝。测定总黄酮时常用芦丁作对照品，对照品与供试品中均加入显色试剂，多用标准曲线法测定含量。（二）单体黄酮成分的含量测定：1、薄层色谱（扫描）法：测定中药制剂中单体黄酮类成分的关键是分离。样品经有机溶剂或水提取后，可用硅胶、纤维素或聚酰胺进行层析，以达到分离的目的。层析后将含有待测成分的色斑用薄层扫描仪直接测定，多用双波长薄层扫描法。2、高效液相色谱法：①由于黄酮类化合物在紫外光区有较强的吸收，故使用HPLC法检测灵敏度较高，因此该法在黄酮类单体成分的定量分析中最常用。

HPLC色谱条件分正相和反相色谱两类，其中反相色谱应用较多。②黄酮类成分的RP-HPLC：固定相大多用C18键合相，流动相常用甲醇-水-乙酸或乙腈-水。黄酮类成分的NP-HPLC：固定相多用氰基或氨基键合相硅胶，流动相可套用薄层色谱条件，但极性要相对小一点。多用于羟基或乙酰化黄酮类的含量测定。③检测器：多用紫外检测器。第三节三萜皂苷类成分分析一、概述：1、三萜皂苷：三萜是由30个碳原子组成的萜类化合物，根据“异戊二烯定则”，多数三萜被认为是由6个异戊二烯（三十个碳）缩合而成，该类化合物在自然界分布广泛，有的以游离形式存在，更多则以与糖结合成苷的形式存在，该苷类化合物多数可溶于水，水溶液振摇后产生似肥皂溶液样泡沫，故被称为三萜皂苷。该类皂苷多具有羧基，所以有时又称之为酸性皂苷。2、生理活性：三萜类化合物具有溶血、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗生育等作用。3、分布：三萜皂苷广泛存在于自然界中，菌类、蕨类、单子叶、双子叶植物、动物及海洋生物中均有分布，尤以双子叶植物中分布最多。含三萜皂苷的具体药材和其相应成分见书P114.二、结构特征及理化性质：（一）结构特征：四环三萜和五环三萜是两种在中药中分布最广的三萜类化合物。1、四环三萜：基本母核为环戊烷骈多氢菲，17位为８个碳原子组成的侧链，母核上有５个角甲基。它包括达玛烷型、羊毛脂甾烷型、大戟烷型、原萜烷型、葫芦素烷型、楝烷型等。2、五环三萜：基本骨架为多氢蒎的五环结构，包括齐墩果烷型、乌苏烷型、羽扇豆烷型、木栓烷型等。甾体皂苷：皂苷元由27个碳组成,共有A、B、C、D、E和F六个环，也有泡沫反应和溶血性，要注意它与三萜皂苷的区别。（二）理化性质：1、性状：游离三萜多有完好的结晶，但三萜皂苷多为无定型粉末,具有苦味和辛辣味,对人体粘膜有刺激性,还具有吸湿性。2、熔点与旋光性：熔点或分解点在200～350℃之间，且均有旋光性。3、溶解性：游离三萜——溶于苯、氯仿等有机溶剂，不溶于水。三萜皂苷——可溶于水，易溶于热水、热甲醇、热乙醇和稀醇，难溶于低极性有机溶剂。正丁醇与水分层且可很好的溶解皂苷，常作为皂苷的提取溶剂。4、显色反应：三萜化合物（苷元和苷）在无水条件下，与强酸、三氯乙酸或Lewis酸（氯化锌、三氯化铝、三氯化锑）作用，会产生颜色变化或荧光，放久褪色。但全饱和且3位又无羟基或羰基的三萜化合物呈阴性反应。（1）醋酐-浓硫酸反应（L-B反应）：将样品溶于醋酐中，加浓硫酸-醋酐（1：20），可产生黄→红→紫→蓝等颜色变化，最后褪色（三萜化合物以显黄色和红色为主，甾体化合物以显蓝色和绿色为主）。（2）氯化锑反应：将样品氯仿或醇溶液点于滤纸上，喷以20%五氯化锑的氯仿溶液（或三氯化锑饱和的氯仿溶液），干燥后60～70℃加热，出现蓝色、灰蓝色，灰紫色等多种颜色斑点。5、表面活性：绝大多数三萜皂苷水溶液强烈振摇后可产生持久的泡沫。6、溶血作用：大多数皂苷的水溶液有溶血作用，但少数皂苷有抗溶血作用。三、定性鉴别：包括理化鉴别和薄层色谱鉴别。薄层色谱鉴别准确度高，是最常用的鉴别方法。理化鉴别包括泡沫反应和化学显色反应鉴别，多用于含皂苷的原料药和组成药物少，皂苷含量高的中药制剂。(一)泡沫反应：取药品粉末约1g，加水10ml，煮沸10分钟后过滤，将滤液于试管内强烈振摇，如产生持久性泡沫(15分钟以上)即为阳性反应。所产生的泡沫多少与pH有关，取2支试管，一管加入0.1mol/L盐酸液5ml，另一管加入0.1mol/L氢氧化钠液5ml，再各加入药品水溶液，使酸管的pH为1，碱管pH为13，强烈振摇，如两管所形成的泡沫高度相同或酸管略高，则中药中含三萜皂甙，如碱管泡沫较酸管泡沫高数倍，则中药中含甾体皂甙。

（二）化学显色反应：包括醋酐-浓硫酸反应、氯化锑反应等,具体操作同前“显色反应”。(三)薄层色谱：（1）皂甙类成分进行薄层分离时采用吸附剂常用的是硅胶或氧化铝以及特殊需要的硅藻土。①亲水性强的三萜皂甙通常要求硅胶的吸附活性较弱些，展开剂的极性要大些，才能得到较好的分离效果。常用的溶剂系统为正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5，上层)。②皂甙元的极性较小，如以硅胶为吸附剂，展开剂要有较强亲脂性，所用的溶剂系统常以苯、氯仿、己烷、异丙醚等为主要组分，再加以少量其他极性溶剂。常用的溶剂系统为环己烷-乙酸乙酯(1∶1)。（2）薄层色谱展开后，三萜皂甙类化合物常用的显色剂：①硫酸-乙醇(1∶1)：喷后加热，显红褐色、紫色、黄色或黑色，与加热温度有关。（最常用显色剂）②碘蒸气：灵敏度约为1～2μg，碘的优点是易挥发，显色后挥去碘，斑点可作定量分析.（3）薄层色谱展开环境：一般控制展开温度在20℃以下，相对湿度在47%左右。四、含量测定：（一）总皂苷的含量测定：总皂甙的含量测定一般需用适当的溶剂(如甲醇、乙醇等)提取，提取后经分离（如水饱和的正丁醇萃取或经大孔吸附树脂处理后溶剂洗脱）得到总皂甙成分，再根据皂甙类化合物的各自特征来选择含量测定方法。最常用的方法是比色法（分光光度法）。1、重量法：①该法主要用于原料药的总皂苷含量测定。②在中药制剂中，当处方中药味含皂苷类成分较多时，常用正丁醇作溶剂，测定正丁醇浸出物重量来当作总皂苷的含量（误差大，不常用）。2、比色法（分光光度法）：①利用皂苷能与某些试剂反应产生颜色的性质于可见光区或紫外光区进行分光光度法测定。常用的三萜皂苷显色试剂有：香草醛-硫酸或香草醛-高氯酸：最常用皂甙类显色剂。浓硫酸：测定皂甙元的一种通用试剂。②用该法测定中药制剂中总皂苷或总皂苷元含量时，可选用单体皂苷或皂苷元作对照品，但要注意单体皂苷或皂苷元与总皂苷的换算系数。换算系数=样品实际含有的总皂苷量÷样品测定吸收度后用单体对照品（绘制的标准曲线）计算所得含量.（二）皂甙元的含量测定：①按总皂甙的提取分离方法得到总皂甙，再加酸(如硫酸、盐酸)加热水解，得到皂甙元；②也可以将样品先行水解，再用有机溶剂从水解后的混合液中提取皂甙元。③测定皂甙元含量的方法主要有薄层色谱扫描法、高效液相色谱法和比色法。④因药品水解后水解产物不能客观反应药品质量，故应尽量避免测水解产物。所以很少对皂甙元进行含量测定。（三）三萜皂苷类单体成分含量测定：主要用薄层色谱法和高效液相色谱法。1、薄层色谱法：可采用薄层洗脱—比色法和薄层扫描法。（1）薄层洗脱—比色法操作步骤：①供试品溶液的制备：包括样品的提取与预处理。②对照品溶液的配制。③薄层板的制备。④点样：对照品与供试品用定量毛细管交叉点样。⑤展开：包括预平衡与样品展开。⑥定位：日光下、紫外灯下观察或碘蒸气定位。⑦斑点捕集：将对照品与供试品斑点小心刮下，同类斑点粉末合并。⑧洗脱与定量：用合适的溶剂洗脱粉末后加显色剂显色，显色后离心取上清液制成比色测定用溶液，以相同大小的固定相为空白同法操作，用分光光度仪于合适波长处比色定量。（2）薄层扫描法操作步骤：①供试品溶液的制备：包括样品的提取与预处理。②对照品溶液的配制。③薄层板的制备。④点样：对照品与供试品用定量毛细管交叉点样。⑤展开：包括预平衡与样品展开。⑥显色：采用合适的显色剂（多用硫酸乙醇溶液）喷雾显色或衍生化显色，在合适的温度下烤干。⑦扫描定量：在稳定显色的时间内，采用薄层扫描仪选择合适的参数扫描定量。2、高效