第4章 基因操作中大分子的分离和分析

第四章基因操作中大分子的分离和分析第一节DNA的分离、检测和纯化第四章基因操作中大分子的分离和分析一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化1.碱裂解法提取E.coli质粒DNA2.通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA1.碱裂解法提取E.coli质粒DNA原理：碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋质粒提取（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌（三）试剂：LB培养基（液体、固体）溶液I 溶液II 溶液III TE(pH8.0)操作步骤接含pUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3mlLBAmp+液体培养基中

370C，190rpm振荡培养过夜

取1.5ml菌液入1.5ml的离心管中

6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体

100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10min

加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体

加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性

12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管

上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）

12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管

（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）

12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管

上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴30min

12000rpm，离心15min

沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（轻弹混匀、离心）

12000rpm，离心10min

晾干沉淀

沉淀用20ulTE溶解，-200C保存2.通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA二、电泳检测（一）DNA的琼脂糖凝胶电泳（二）聚丙烯酰胺电泳（三）脉冲场凝胶电泳（一）DNA的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型DNA的移动速度依次为：共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。影响迁移率的因素DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压（一般5V/cm）、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成等。常用染料EB:溴化乙锭EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中可胶中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。SYBRGreenI是高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单：无须脱色或冲洗。至少可检出20pgDNA，高于EB染色法25-100倍。由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋提纯和未提纯质粒DNA电泳图pGFPpBSKM（二）聚丙烯酰胺电泳（三）脉冲场凝胶电泳三、DNA片段的纯化1．低熔点琼脂糖凝胶电泳法低熔点琼脂糖在水溶液中的溶解温度（meltingpoint）很低，在65℃以下；当温度降低到20-30℃时凝结成固形物。如果需要分离特定的DNA片段，可用低熔点琼脂糖凝胶进行分析，然后切割带有目标DNA的琼脂糖凝胶块，加入适量缓冲液，加热到60℃，凝胶溶化，DNA进入水溶液中，最后通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀获得纯化的DNA片段。

2．透析袋电洗脱法将含有目标DNA片段的琼脂糖凝胶块切割下来，放在透析袋中，置于电泳缓冲液中电泳，DNA将从凝胶块中“跑”出来。常用于回收5kb以上的DNA片段。

3．GlassMilk（bead）结合法琼脂糖凝胶在3倍体积的3MNaI溶液作用下于55℃会溶化，从而将DNA释放到水溶液中；在这样的高盐浓度下，有一种硅珠可特异性吸附DNA。当硅珠吸附DNA后，通过离心的方法很容易对硅珠进行洗涤，然后用水或低盐缓冲液可从硅粒中将吸附的DNA洗脱出来。4．Qiagen纯化柱第二节RNA的分离、检测和纯化第四章基因操作中大分子的分离和分析一、控制潜在的RNA酶的活性1．溶液和用具的去RNA酶处理用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水浸泡后再灭菌，或购买无RNA酶污染的用具。对于电泳用具最好使用专用的，不要用于其它分析，在使用之前用洗涤剂洗涮干净，再用3%H2O2和0.1%DEPC处理的水浸泡，清洗干净。

2．RNA酶抑制剂的使用为了进一步防范RNA降解，一般在RNA样品和RNA反应中加入RNA酶抑制剂，现在应用较多的是蛋白类抑制剂，如人胎盘RNase抑制剂。除此之外，还有氧铜核糖核苷复合物（完全抑制剂，且抑制体外翻译）和硅藻土（吸附RNase吸附剂）。

二、RNA的抽提和纯化1．酚-异硫氢酸胍抽提法TRIZOL试剂是使用最广泛的抽提总RNA的专用试剂由Gibco公司根据酚-异硫氢酸胍抽提法设计，主要由苯酚和异硫氢酸胍组成对任何生物材料的RNA提取，首先研磨组织或细胞，或使之裂解；加入该试剂后，可保持RNA的完整，同时进一步破碎细胞并溶解细胞成分；加入氯仿抽提，离心，水相和有机相分离；收集含RNA的水相；通过异丙醇沉淀，可获得RNA样品。

组织RNA的提取：把液氮冻存的组织放到冰冻的碾钵中碾碎，加入适量的Trizol试剂（1mL/100mg组织）裂解组织，冰上放置5min。吸入1.5mL离心管中，加入氯仿(0.2mL/mLTrizol)，冰上放置5min。10000×g离心10min，吸取上清于另一离心管，加入等体积的异丙醇，室温放置10min。10000×g离心15min，去上清，70%乙醇洗涤沉淀，室温风干，加DEPC处理的双蒸水溶解。2．硅胶膜纯化法RNeasy试剂盒是由Qiagen公司设计其设计思路与DNA的分离纯化思路相似含有目标核酸的细胞破碎液通过硅胶膜时，核酸吸附在硅胶膜上，从而与其它细胞成分分开然后在低盐浓度下核酸可从硅胶膜上洗脱出来。三、mRNA的纯化mRNA的纯化主要是针对真核生物而言的由于真核生物mRNA的3‘端有一个poly（A）尾可用亲和层析的方法纯化有许多类型的商业化层析柱可用于mRNA的纯化。

四、RNA的电泳检测RNA的浓度和纯度可通过测试其OD260来判断OD260为1时相当于浓度为40mg/ml。要直观地观察RNA的存在以至于分析，可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来完成。

1．琼脂糖凝胶电泳通过琼脂糖凝胶电泳进行RNA分析和DNA分析的原理是类似的。不同的是，RNA分析是在变性的条件下进行的。常用的变性剂为甲醛，也可使用氢氧化甲基汞和乙二醛-二甲基亚砜（DMSO）。2．聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用来分析小分子量的单链核酸，如小分子量RNA寡核苷酸、DNA序列分析等。其变性条件可用加热方式，或使用尿素等变性剂。电泳检测结果有三条清晰的rRNA带：28S，18S和5S，表明RNA未降解TotalRNA第三节分子杂交第四章基因操作中大分子的分离和分析Southern杂交Northern杂交Western杂交一、Southern杂交DN