gf-1局部注射联合自体骨髓移植对骨延迟愈合的促进作用

gf-1局部注射联合自体骨髓移植对骨延迟愈合的促进作用

骨延迟匹配和非骨折是骨折的常见并发症，发病率约为5%10%，治疗困难。这是骨科临床常见病之一，人们对此进行了大量研究。本院课题组运用转化生长因子β1(Transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)局部注射联合经皮自体骨髓移植治疗兔桡骨骨折延迟愈合,取得了较好的实验效果。现总结报告如下。1材料和方法1.1试剂转化生长因子β1试剂(100μg/1ml)符合参考文献方法,从人血小板中提纯鉴定。1.2动物1.3方法1.3.1菌条件下手术选取健康雄性新西兰大耳白兔(2.0~2.5kg)40只,戊巴比妥钠静脉麻醉(30mg/kg),无菌条件下手术,以实验白兔左前肢桡骨中段处为中心作一3cm长纵行切口,切开皮肤及浅筋膜,同时切除6mm长的桡骨与骨膜,骨折端髓腔用骨蜡封闭,造成骨缺损骨延迟愈合模型,逐层缝合,关闭切口无需内、外固定。术后兔子自由活动,48小时后更换敷料,5天内用青霉素40万单位肌肉注射预防感染,按相同条件常规饲养。1.3.2自体血的检测40只新西兰白兔随机分为空白对照组(A组)、骨髓移植组(B组)、TGF-β1组(C组)、试验组(D组),每组10只。骨缺损模型建立后5天和10天,分别再次麻醉各组实验白兔。16号骨髓穿刺针在任意一侧白兔股骨大粗隆顶端进入骨髓腔内,快速抽吸骨髓液2ml。同时用5号针头从白兔的耳缘静脉抽取自体血2ml。然后按如下要求治疗:A组于骨延迟愈合区注入自体血液2ml,生理盐水1ml;B组于骨延迟愈合区注入自体红骨髓2ml,生理盐水1ml;C组于骨延迟愈合区注入自体血液2ml,TGF-β11ml(100μg);D组于骨延迟愈合区注入自体红骨髓2ml,TGF-β11ml。1.4观察指标1.4.1桡骨干片的he染色术后4周各组实验白兔应用心内注射过量戊巴比妥钠(250mg/kg)随机处死5只,取下左侧桡骨用10%甲醛固定,混合脱钙液脱钙,逐级脱水,石蜡包埋,作5μm切片,HE染色,光镜观察。1.4.2平均体积的测定在HE染色切片上,取外骨痂远、中、近3个视野,利用微机图像处理系统处理切片图像,分别计算出骨折后4周骨痂内骨生成细胞和成骨细胞的体积密度(Vvt)、数量密度(Nv)和平均体积(Vv)。1.4.3桡骨骨髓组织病理学测定各组实验白兔在术后8周应用心内注射过量戊巴比妥钠(250mg/kg)处死,取骨痂标本前完整取下左桡骨并清除周围软组织,用游标卡尺测定桡骨骨痂中份矢状面、冠状面直径以及断端处骨痂厚度。根据阿基米德原理测定骨密度。1.4.4骨折愈合处力学特性的测定力学测试的桡骨在4小时内完成取材,贮存在林格氏溶液中(4℃,pH7.4)。采用三点弯曲试验方法测试骨折愈合处的力学特性。桡骨置于三点弯曲材料测试机(岛津AG-20K1VA型),恒定变形率为5mm/min,跨距4cm,测定出最大抗弯强度(极限负荷)、极限应力、极限刚度和极限负荷时的能量吸收。1.4.5通过测量单位质量骨胶中的钙含量取骨折近端骨痂,经漂洗、脱脂、烘干后,精确称重,用三氯乙酸0.1g/ml脱钙,回滴定法测定钙含量。1.5统计评估2.3骨瘤厚度和骨密度在骨折8周后,D组桡骨骨痂中份的冠状径和矢状径显著性高于A组(P<0.05);骨痂厚度和骨密度非常显著性高于A组(P<0.01);骨痂厚度改变显著性高于B组和C组(P<0.05),而且B组和C组显著性高于A组(P<0.05),结果见表2。2.4能量吸收显著性D组骨折愈合处的最大抗弯强度、极限应力、极限刚度和极限负荷时的能量吸收均非常显著性高于A组(P<0.01),显著性高于B组和C组(P<0.05);B组和C组极限应力、极限刚度和极限负荷时的能量吸收,均非常显著性高于A组(P<0.01),结果见表3。2.5各组显著性比较D组骨痂中钙含量[260.67±9.96(g/mg)]非常显著性高于A组[222.04±13.91(g/mg)](P<0.01),显著性高于B组[242.67±11.49(g/mg)]和C组[241.78±8.42(g/mg)](P<0.05),B组和C组显著性高于A组(P<0.05)。3外源性tgf-1局部注射联合经皮自体骨髓移植促进骨折愈合的必要性转化生长因子可分为5大类,目前研究得较为清楚的是TGF-α和TGF-β。TGF-α可与EGF受体结合,激活酪氨酸激酶,最终引起细胞分裂。TGF-β具有促进细胞增殖、调节细胞分化、促进细胞外基质合成和调节机体免疫的作用,特别在骨形成和骨重建过程中起着极为重要的作用。体外实验表明,TGF-β可促进骨膜间充质细胞的增殖和分化,促进骨(软骨)细胞的增殖,刺激Ⅰ型胶原、骨连接素和骨桥蛋白的合成。Goujon在l869年通过兔子实验发现,骨髓具有成骨能力。20世纪60年代以来,一些研究者报道松质骨主要由骨髓中的成骨干细胞分化而来。许多研究者已将骨髓的成骨能力应用到实际工作中,如在异体骨移植的同时混入部分在手术中获得的骨髓来增加移植骨的成骨特性。在动物实验中,Connolly等指出,骨髓的成骨能力和骨髓细胞浓度间存在正相关,并且在临床上通过单纯自体骨髓移植成功地治愈了骨不连。最近的研究发现,骨髓中结缔组织母细胞在不同个体间存在着显著的个体差异,然而,其有效性与移植骨髓中母细胞的数量有关。自髂嵴获取的骨髓如果不经过浓缩处理,其母细胞数量并不能达到治疗骨不连的理想数目。添加生长因子可以增加母细胞数量,提高自体骨髓移植促进骨愈合的疗效。同时研究还发现。外源性TGF-β1可以增加母细胞数量,具有较强的促进骨愈合作用。骨折延迟愈合多因感染、骨折段血供受损及固定不恰当等造成新骨生成过程中成骨受阻,缺损间隙由纤维组织填充,骨端未能达到骨性愈合,形成骨折延迟愈合。目前有多种治疗方法,物理方法有体外冲击波、磁场体外诱导等;手术方法则在内固定的同时于缺损区植入修复材料(骨材料,骨替代材料)来促进骨折愈合。而目前最佳的修复材料,仍然是自体骨的移植及同种异体骨的运用,但受到一定条件的限制。骨折修复的最终目的是尽可能恢复受伤骨的最大力学强度,修复骨折不仅要恢复骨骼形态的连续性,更重要的是要重建骨骼的支撑功能。骨折愈合后外力作用其上时,会引起骨骼的变形,这些变形的性质、大小与骨的几何形状、骨组织的材料特性有关。所以骨折愈合评估不能单独从组织学方面的变化来研究,更重要的是要从骨折愈合后可承受负荷能力的生物力学参数来定量分析。因此,笔者运用组织学方面研究兔桡骨骨折延迟愈合的同时又采用了生物力学方法,从结构力学和材料力学方面,探讨外源性TGF-β1局部注射联合经皮自体骨髓移植对兔桡骨骨折愈合后整体骨骼生物力学强度的影响。从愈合骨骼的几何参数结果来看,TGF-β1联合自体骨髓移植组在骨折愈合后的生物力学强度上,明显优于单用自体骨髓移植或者单用TGF-β1局部注射组,而后两组明显优于空白对照组。可见,在骨折区局部联合注射TGF-β1及自体骨髓,可使骨折部位骨痂量、单位骨痂的钙含量增加,有明显促进骨组织生成和骨折愈合作用并增强骨折愈合后的生物力学强度。综上所述,本文的结论是,TGF-β1局部注射联合经皮自体骨髓移植能促进骨折愈合,增强骨折愈合后的生物力学强度,两者合用具有良好的协同作用,是治疗骨折延迟愈合的一种有效方法。试验结果将为未来临床开发应用提供可靠的依据。雄性新西兰大耳白兔(2.0~2.5kg)由福建医科大学实验动物中心提供。计量资料以表示,对各组数据进行方差齐性检验,方差齐性数据组间均数用LSD法检验进行两两比较,方差不齐性数据组间均数用Dunnett法检验两两比较。2结果2.1如图所示2.2成骨细胞测定结果术后4周,在骨痂内骨生成细胞测定方面,D组的Vvt非常显著性高于A组(P<0.01),B组、C组和D组的Vv非常显著性高于A组(P<0.01)。在成骨细胞测定方面,D组的Vvt