带蒂筋膜瓣包裹超临界骨缺损的实验研究

带蒂筋膜瓣包裹超临界骨缺损的实验研究

骨缺损的临床治疗难度大，治愈率高。膜引导骨再生(membrancguidedboneregeneration,MGBR)技术为目前临床修复超临界骨缺损(exceedcriticalsizedefect,ECSD)的研究热点,其核心问题为屏障膜的选择及成骨空间的维持,据此,我们设计本实验,论证带蒂筋膜瓣具有MGBR作用且其包裹非细胞型组织工程化骨(noncelluartissueengineeredbone,NTEB)填充骨缺损,对促进骨ECSD修复是可行的且疗效明显。1材料和方法1.1骨诱导活性材料4~5月龄新西兰大白兔50只,雌雄不限,体重2.0~2.5kg;骨诱导活性材料(osteoinductiveabsorbingmaterial,OAM);骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)。1.2透射光密度计BX51显微镜;Konica190X线机;Pehamed-Densoquick2型透射光密度计;超速离心机;生物力学试验机BOSE3520-AT型。1.3方法1.3.1复合自体骨髓基质联合细胞nm的制备将50只兔行放血干预动员,5d后抽取自体红骨髓(autologousredbonemarrow,ARBM)8mL。经离心纯化稀释处理,获得浓度为1×108个/mL的单核细胞悬液2mL,浸泡经处理的合适大小OAM10min后,将复合自体骨髓基质干细胞(bonemarrowstemcell,BMSC)的OAM制备成NTEB。经测定自体BMSC在OAM中含量为2×107个/cm。1.3.2带蒂肌力瓣的nteb所有动物随机分为A、B两组,每组25只;无菌手术造右尺骨中段2cm骨缺损,植入修整后的NTEB,A组单纯植入NTEB,B组以带蒂筋膜瓣呈圆桶状包裹NTEB1圈固定;逐层缝合,肢体未行固定,常规喂养,16万U硫酸庆大霉素肌注3d,1次/d。1.4观察指标1.4.1一般情况下1.4.2放射学检查术后4、8、12、16周摄兔右尺桡骨正位X线片,动态观察NTEB吸收降解及新骨再生情况。1.4.3一般观察和学校研究术后4、8、12、16周每组各处死4只动物取材,观察NTEB表面大体变化及骨缺损部位成骨情况。1.4.4织学评分法检测新生骨小梁面积根据LaneSandhu骨移植物组织学评分法,术后4、8、12、16周在图像分析仪下进行组织形态分析,测定新生骨小梁面积占修复区面积的比值。1.4.5生物力学评价的分析术后8、12、16周,每组3只动物解剖取新鲜尺骨骨干,作三点弯曲生物力学测定,记录所需载荷。1.5统计分析采用SPSS13.0统计软件包。数据以均数±标准差表示,组间比较采用方差分析,两两比较采用q检验,P<0.05时为差异有显著性。2结果2.1一般情况下术后7d内动物一般状况差;B组较A组前肢功能恢复快,表现为术后2周开始重度跛行,4周轻度跛行,8周恢复术前状态。2.2植入物密度及骨干结构X线片检查示,术后4周A组植入物密度稍低,骨断端间隙清晰;B组植入物密度明显降低,骨断端间隙已不明显,少许外骨痂形成。术后8周,A组植入物密度较低,间隙仍明显,无外骨痂形成;B组植入物周边有板层状或梭形规则阻射影,材料部分降解,植入物与尺骨断端间隙消失。术后12周,A组有外骨痂形成并包裹植入物;B组初步形成骨干结构,骨皮质连续,部分髓腔再通。术后16周,A组植入物降解较明显,再生新骨形成少,初步形成骨干结构,但骨皮质不连续,髓腔不通;B组植入物完全降解,正常骨干结构形成,骨髓腔完全再通(图1)。2.3术后骨髓组织结构观察A组:术后4周,可见交界区纤维结缔组织连接,镜下大量纤维结缔组织长入,散在有软骨细胞,新生骨小梁极少;8周时纤维结缔组织在新生骨小梁结构内延伸,散在有软骨细胞团及异物巨细胞反应;12周骨痂生长紊乱,交界区间隙不明显,镜下见紊乱的纤维性骨痂,骨小梁结构形成较少;16周时植入物部分降解且再生新骨极少,但与骨干形成一个整体,镜下见交界区纤维结缔组织依然存在,植入物内有发育较成熟的骨小梁,髓腔未通。B组:术后4周,筋膜瓣形成骨膜样组织,膜下修复区软骨样组织连接,镜下骨膜样结构阻挡周边软组织进入修复区,植入物降解明显且散在发育中骨小梁和软骨细胞团,未见淋巴细胞浸润;8周骨膜样组织下骨痂形成且包裹植入物,镜下见植入物内部有发育较成熟的骨小梁骨及软骨组织;12周新骨生成较多,与骨干形成一个整体,镜下见植入物接近完全降解,有大量成熟骨小梁形成并层状整齐排列,骨髓腔部分再通;16周时筋膜瓣形成似骨膜样组织,修复区骨皮质连续,骨干结构重塑,镜下见植入物已降解,由新骨替代,新骨中散在少量软骨,成熟骨结构形成,骨髓腔再通(图2)。2.4修复区域内骨形态的测量分析术后各时间点两组新生骨小梁面积占镜下修复区面积的比值比较,及组内不同时间比较差异均有统计学意义(P<0.05)(表1)。2.5两组力学强度测定术后同一时间点经修复的尺骨三点弯曲生物力学测定显示B组力学强度明显大于A组,差异有显著性(P<0.05),同组不同时间点前后比较,差异有显著性(P<0.05)(表2)。3讨论3.1骨膜样组织的形成带蒂筋膜瓣为深筋膜与皮下真皮血管网之间的组织膜,制取技术成熟且本身血供丰富,设计灵活性大。通过本实验,B组4周时筋膜瓣贴附于组织工程骨表面,形成半透明的骨膜样组织;16周时骨膜样组织依然存在且其阻止周围纤维结缔组织进入骨缺损修复区作用明显(图2);而A组同期未见骨膜样组织形成。证明带蒂筋膜瓣作为MGBR的屏障膜可行,其引导NTEB再生新骨明显。3.2修复区的骨作用通过本次试验观察,NTEB对成骨空间的维持作用明显。其在体内开始降解的时间不少于4周,完全降解的时间至少为12周,满足MGBR技术的要求;带蒂筋膜瓣与NTEB结合在促成骨方面作用明显。NTEB提供BMSC生长支架,控制BMP释放,且在带蒂筋膜瓣形成的成骨空间内,局部聚积,保证了BMSC和BMP浓度;同时,BMP诱导下不仅可提高OAM单位体积内BMSC、成骨细胞的数量和活性,还能够在修复区内外高效诱导血管周围的间充质细胞或BMSC,增殖转化为软骨细胞和成骨细胞,并以软骨化骨为主、膜内化骨为辅形成新骨。通过修复区成骨情况观察,B组在植入物降解、新生骨形成、骨断端交界区连接、骨干正常结构形成、骨髓腔再通等方面均优于A组,表现为术后的疗效即术后B组实验动物前肢功能较A组恢复早,说明B组植入物早期起到机械支撑和增加力学强度,后期经生物降解而形成新骨,起到了良好的骨诱导、骨传导和骨支撑三重作用。通过组织学观察,B组随着时间的推移植入物周边及内部骨小梁和软骨细胞团增多明显,且大量成熟骨小梁形成,NTEB完全降解,骨髓腔再通,而同一时间段A组成骨作用较差。根据修复区内骨形态计量分析(见表1),B组骨小梁体积明显大于A组,且同一组不同时间点评分,随着时间的推