带蒂筋膜瓣作膜诱导技术制备自体红骨髓的组织工程骨血管化

带蒂筋膜瓣作膜诱导技术制备自体红骨髓的组织工程骨血管化

由于各种原因，骨缺损超过一定长度后，无法进行骨性愈合。这是骨科修复领域的难题之一。组织工程骨和膜引导性骨再生是目前治疗骨缺损研究的热点。用自体骨髓分离纯化的BMSCs体外培养扩增后接种的组织工程骨因种种缺陷，严重限制了其在临床上的应用与推广。而未经分离纯化的自体骨髓接种的组织工程骨和各种生物隔膜引导性骨再生的临床实用性强，但前者缺乏血管化作用，骨修复时间长，成骨能力差；后者缺乏膜内充填物的支持和修复大段骨缺损的能力。为此我们研究将两者结合，利用带蒂筋膜瓣作膜诱导技术，将自体红骨髓接种的组织工程骨血管化并作为膜内充填物修复大段骨缺损，为临床应用提供理论依据。1材料和方法1.1体外钙磷库aem-双网亚4～5月龄新西兰大白兔32只，雌雄不限，体重2.0～2.5kg，由河北北方学院动物实验室提供。生物支架材料：骨诱导活性材料（osteoinductiveabsorbingmaterial,OAM，天津中津生物发展有限公司），由多孔磷酸钙人工骨作为载体，与rhBMP-2复合构成，为疏水嗜酸性糖蛋白，相对分子质量为（18.0±0.5）×103;OAM呈2.0cm×0.5cm×0.5cm条块状，具有天然多孔结构，孔径>300μm，孔隙率>80%，与BMSCs、BMP具有良好的组织相容性，每条含BMP≥10mg，可实现BMP-2缓释，且有与人体骨组织矿物质相似的钙磷比（<1.6）与晶体结构，力学强度可靠且可在体内逐步降解，降解后的钙参与局部新骨形成或进入机体的钙磷库，以正常方式排出体外。Pehamed-Densoquick2型透射光密度计（Konica公司，日本）；CMIAS-99图像分析仪（北京航空航天大学图像中心）；BX51显微镜（Olympus公司，日本）。1.2自体红骨髓arbm于32只兔耳缘静脉抽血5mL行放血干预动员，5d后从双侧股骨大粗隆处用10mL骨髓穿刺针（含100U/mL肝素0.2mL）分别抽取自体红骨髓（autologousredbonemarrow,ARBM)2mL，共4mL；将2.0cm×0.5cm×0.5cm条块状OAM置于含16万U庆大霉素的抗生素生理盐水中复水15min取出，放入含4mLARBM的注射器中充分浸泡混合，至ARBM出现凝固并均匀附着在OAM表面约5min，制成2.0cm×0.5cm×0.5cm大小ARBM接种的组织工程骨，使用前配置。1.3自体-骨缺损克氏原螯虾膜瓣的制备取所有动物采用5%氯胺酮（3mg/kg）耳缘静脉麻醉，无菌显露双侧桡骨中上段，自桡骨小头下4cm处向远侧截除桡骨干及其骨膜，造成2cm长桡骨中段骨-骨膜完全缺损。左侧为对照组（A组），将ARBM接种的自体组织工程骨嵌入骨缺损。右侧为实验组（B组），利用显微外科技术，于邻近骨缺损处制备一5cm×3cm带无名血管蒂的毛细血管网筋膜瓣，通过隧道移位至骨缺损处，将筋膜瓣呈圆桶状包裹自体ARBM组织工程骨1圈，保持两端开放，紧密嵌入骨缺损，用10-0无创线将筋膜瓣两端固定在骨缺损断端骨膜或软组织上，覆盖骨连接处，逐层缝合伤口。术后连续3d两组动物臀大肌注射硫酸庆大霉素注射液，16万U/次，每日1次。1.4测试指标1.4.1一般情况下术后观察动物的饮食、活动及伤口愈合情况。1.4.2骨缺损线片的测定术后4、8、12、16周对每只兔分别摄双侧尺桡骨正位X线片，每侧系统选片5张，在骨缺损区范围内随机选取6个测试点，用透射光密度计测定其实际吸光度（A）值及空曝区最大A值，计算两者A值比，观察骨缺损修复过程的动态变化。1.4.3植骨部位评估术后4、8、12、16周取双侧整段尺桡骨，大体观察骨缺损修复程度及骨痂生长情况。取植骨部位，用4%中性甲醛固定，稀盐酸脱钙，乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，HE、VanGieson染色，光镜下观察骨缺损修复成骨及再血管化情况。术后12周，取8只动物从腋动脉注入墨汁，大体解剖及光镜下观察骨缺损区再生骨组织的血管分布情况。1.4.4组织片的选择根据Lane-Sandhu骨移植物组织学评分法，将术后各时间点各组所有组织块行连续切片，每块组织系统选片5张。在放大100倍条件下，每张切片上随机选取5个视野，在图像分析仪下进行组织形态分析，测定两组各时间点新生骨小梁面积占镜下修复区面积的比值。1.4.5血管面积测定选取组织工程骨与正常骨交界部位两端各2mm范围，进行连续切片，每个组织块选片5张，在放大100倍条件下每张切片随机选取5个区域，图像分析仪测定血管面积，除以区域面积，即为单位面积内的血管面积。1.5两组均数标准差的统计学处理采用SPSS11.5统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验，两两比较采用Studentt检验方法，P值<0.05为有统计学意义。2结果2.1动物肠道感染、腹泻和干草原感染1d术后3d,A、B组分别有3只和2只动物单侧肢体伤口有红肿和渗出，行聚维酮碘液冲洗、换药、抗感染治疗，B组2只伤口感染情况好转；10d后A组2只因肠道感染、腹泻脱水死亡，1只伤口感染裂开植入物脱出而退出实验，退出实验的3只动物均予以补齐。其余动物伤口均于12d拆线，切口Ⅰ期愈合。术后7d内动物精神差，拒活动或活动极少，食量减少，体重下降，毛发蓬松无光泽，皮下脂肪减少，针刺反应迟钝；术后8d动物前肢开始重度跛行，食量增加；12d变为轻度跛行，食量恢复；16d逐步恢复术前状态。2.2正常骨干结构的形成X线片检查示，术后4周A组植入物纹理清楚，骨质密度稍低，骨断端间隙清晰可见；B组植入物纹理模糊，骨质密度降低明显，截骨断面与植入物间隙已不明显，有少许外骨痂形成。术后8周，A组植入物纹理模糊，骨质密度较低，截骨断面与植入物间隙不明显，无外骨痂形成；B组外骨痂少，植入物与桡骨断端间隙消失。术后12周，A组有少量外骨痂形成并包裹植入物；B组初步形成骨干结构，骨皮质连续，部分髓腔再通。术后16周，A组骨痂生成并初步形成骨干结构，骨皮质不连续，髓腔不通（图1a）;B组正常骨干结构形成，骨髓腔完全再通（图1b）。A值比测量结果显示，术后4周两组A值比差异无统计学意义（P>0.05）；以后各时间点两组间比较，及同组内各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。2.3术后植入物组织病理学观察大体观察：术后4、8周，A组植入物与桡骨断端间有纤维结缔组织连接；B组带蒂筋膜瓣与植入物生长为一体，形成类似骨膜样组织，剥开此组织，植入物与桡骨断端之间有软骨样组织连接，少量骨痂包裹植入物。术后12周，A组除少量骨痂包裹植入物外，截骨断面与植入物间隙已不明显；B组新骨生成较多，与骨干形成一个整体。术后16周，A组骨痂包裹植入物，与骨干形成一个整体（图2a）;B组骨缺损区骨皮质连续，骨干结构重塑（图2b）。组织学观察：术后4周，A组纤维结缔组织长入植入物内部，有散在软骨细胞团形成；B组植入物内部有血管长入，有散在发育中骨小梁和软骨细胞团形成，未见明显淋巴细胞浸润。术后8周，A组纤维结缔组织增生并向新生骨小梁结构内延伸，有异物巨细胞反应，血管结构不明显（图3a）;B组植入物内部有较丰富血管长入，并有发育较成熟的骨小梁骨及软骨组织形成（图3b）。术后12周，A组骨断端间有少许纤维结缔组织，植入物表层即骨痂表层有散在血管结构、纤维性骨痂形成，植入物内部即骨痂深层骨小梁及血管结构较少；B组见血管丰富及大量成熟骨小梁形成，骨髓腔部分再通。术后16周，A组骨断端之间仍有纤维结缔组织相连，植入物内血管长入及发育较成熟的骨小梁均较少，骨髓腔未通（图3c）;B组植入物残骸已吸收降解，完全由新骨替代，新骨中散在少量软骨，成熟骨结构形成，血管结构减少或消失，骨髓腔再通（图3d）。墨汁灌注检查：术后12周，A组大体解剖见植入物外周纤维组织表层着色很淡，无墨染的小血管，剖开表层见深部软组织墨染不明显，植入物内部可见极稀疏墨染的小血管束分布；镜下仅能见到成骨区稀疏的墨染区（图4a）。B组大体解剖见植入物外周纤维组织表层着色较淡，有数根墨染的小血管，剖开表层见深部软组织墨染极明显，植入物内部可见密集墨染的小血管束分布，紧密贴附于组织工程骨表面，行程不超过2mm即长入孔隙内部；镜下见成骨区墨染数量多，且较密集（图4b）。2.4小梁面积占镜下修复区面积的比值以及b组内不同时间的比较术后4、8、12、16周两组新生骨小梁面积占镜下修复区面积的比值比较，以及B组内不同时间比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。2.5积内血管再生面积术后4、8、12、16周，骨修复交界区单位面积内血管再生面积B组明显多于A组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。术后16周，B组随着成熟骨结构形成，血管结构减少或消失。3讨论3.1arbm与uam复合的方法经典的骨组织工程学方法是将BMSCs作为种子细胞种植于某种支架材料,在生长因子的存在下经一定时间体外培养过程,再植入体内达到修复骨组织的目的。该方法操作复杂,容易污染,且需时较长,临床应用困难较大。而将种子细胞复合具有支撑力的支架材料和生长因子,不经体外培养过程直接植入骨修复区获得成骨效果,有很大的临床潜力。有学者将ARBM和生长因子复合即时植入,用于促进骨折愈合已获满意效果。由于不需体外培养过程,仅在抽取ARBM后与支架和生长因子复合并立即植入,被称为“自体ARBM接种的组织工程骨”,该方法操作简便,临床实用性强。OAM既能补充定量外源性并证明有诱导活性的BMP,又能复合在能使BMP缓释的天然三维互相交通的网孔结构载体内。ARBM与OAM复合可构建成具有种子细胞、骨生长因子和吸附载体为一体的组织工程骨。因独特的结合方式,在适宜的体内理化和营养环境下,ARBM的促骨生成作用在骨缺损修复和重建时明显增强，其中骨源性干细胞在BMP诱导下成骨的活性最强，是骨愈合过程中骨化的重要细胞。BMP诱导ARBM通过膜内化骨和软骨化骨形成新骨，而OAM是由人工骨构成，除了能充填骨缺损并增加力学强度外，还能逐渐经生物降解形成新骨，具有良好的骨诱导、骨传导和骨支撑作用。3.2带蒂肌力瓣包裹对骨缺损修复的作用组织工程骨的再血管化即充足的血供，是保证其体内成活并发挥生物学效能的决定性因素。筋膜组织本身具有良好的通透性和丰富的毛细血管网，可使体液内的营养物质进入缺损部位，给骨细胞的再生提供一定营养。带蒂筋膜瓣除了保留筋膜自身血供外，在显微镜下观察还带有无名血管蒂所属血管网，使筋膜瓣血液循环更丰富。其包裹复合物在构建组织工程骨的同时建立其血供，形成血管化的组织工程骨，可使血液中营养物质进入缺损部位，保证植入OAM内部的ARBM中BMSCs能获得及时充分的营养，延长细胞寿命，减少凋亡率，使骨缺损得以修复。我们通过向筋膜的来源血管注入墨汁，观察骨缺损区再生骨组织的血管分布情况，以及选取组织工程骨与正常骨交界部位，用图像分析仪测量单位面积的血管面积，动态观察组织工程骨在体内血管化的进程，发现同一时间点B组与A组相比，单位面积内血管数量及质量均有明显优势（P<0.05）；但随着成熟骨结构形成，血管结构逐渐减少或消失，提示带蒂筋膜瓣包裹对组织工程骨的血管化进程早期有明显促进作用。从X线片、大体形态和组织学观察结果看，两组同一时间点无论植入物内部血管的长入、骨小梁及软骨组织形成的数量和速度，还是成熟骨结构的形成、骨干结构的重塑、骨髓腔的再通、植入物的吸收降解，B组体内成骨的能力和修复骨缺损效果均明显优于A组。通过A值比测定和修复区内骨形态计量分析，B组所形成的骨组织中心未见骨坏死或空隙状未成骨区（P<0.05）。一般情况观察显示，B组2只动物在感染环境下，骨缺损仍得到修复，移植骨成活，说明有其独立血供，自身修复能力和抗感染能力强，即使在感染部位也可存活。3.3带蒂肌力瓣作膜诱导术应用膜引导技术，以筋膜作为膜材料包裹自体组织工程骨可防止其散漏并充填骨缺损。Verschueren等研究发现具有成骨潜能的间质细胞向缺损区生长，移行速度慢于周围结缔组织；而筋膜瓣覆盖骨缺损将其作为骨端骨膜再生支架，机械性地阻碍了纤维结缔组织和周围软组织进入骨缺损部位，保持骨缺损部位有相对稳定的环境，使骨生成细胞优先生长，产生新骨而达到促进骨性愈合的目的。我们的研究通过X线片及大体形态观察，术后4周时B组的带蒂筋膜瓣形成类似骨膜样组织，骨断端间隙已不明显，以后各时间点所形成的外