哺乳动物组织基因组DNA提取实验报告

实验序号实验名称哺乳动物组织基因组DNA提取实验时间是否小组合作是（√）否（）一．实验预习1．实验目的：（1）掌握动物基因组DNA提取的原理和操作方法；（2）掌握相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。2．实验原理：1）本实验利用去垢剂SDS(十二烷基磺酸钠)是为了使蛋白变性并溶解细胞膜中的脂质从而导致细胞裂解，而细胞裂解物又常用蛋白酶K和蛋白进行水解处理。随后用酚：氯仿进行抽提，以去除残留的蛋白质，这时蛋白质将进入有机相，或者假如己变性的话将呈现在有机相与水相之间。氯仿处理是为了去除苯酚，而乙醇沉淀处理则可以浓缩DNA，同时去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。2）为了进一步保护DNA样品的完整性，通常需要在缓冲液中添加乙二胺四乙酸(EDTA)以整合Mg2+，这样将会减少脱氧核糖核酸酶(DNase)的活性，因为该酶必须在有Mg2+存在时才会起作用。3）本实验方法分离得到的染色体DNA样品易被限制酶切割，用此方法得到的DNA长度为100~150kbp，因此，较适用于适用于λ噬菌体基因组文库和Southern杂交的研究。如果所制备的基因组DNA是用于构建克隆文库，要求得到较大分子量的DNA，则必须省略其中的振荡步骤3．实验器材与试剂：（1）实验仪器（apparatus）：高压灭菌锅（Autoclave）、电子天平（Electronicbalance）玻璃匀浆器（Glasshomogenizer）、高速冷冻离心机（Highspeedrefrigeratedcentrifuge）、超低温冰箱（Ultracoldstoragefreezer）、微波炉（microwaveoven）、微量加样器（Pipettes）、电泳系统（ElectrophoresisSystem）、紫外透射仪（Ultraviolettransilluminator）、恒温水浴锅（constanttemperatureboiler）等；（2）实验材料（Material）：小白鼠（Liverofmice）（3）实验试剂（Reagents）：50ml生理盐水（0.85％NaCl）、Aceticacid(醋酸)、dddH2O（三蒸水）、Phenol（苯酚）、Chloroform（氯仿）、Ethanol（乙醇）、Isoamylol（异戊醇）、TEbuffer（TE缓冲液）、Boricacid（硼酸）、Sugar（蔗糖）、Agarose（琼脂糖）、Bromophenolblue（溴酚蓝）、GelviewFluorescentdye（Gelview荧光染料）及NaOH等。注意：以上试剂均需高压灭菌。此外的还需要的试剂及其配制方法如下所示：①5mol/L氯化钠（NaCl）：溶解14.6g氯化钠于足量的水中，定容至50ml；②0.5mol/L乙二胺四乙酸pH8.0（EDTA）:配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取9.31g的Na2EDTA·2H2O和1g的NaOH，pH调至8.0，并溶于约40ml水中，定容至50ml③3mol/L乙酸钠pH5.2（Sodiumacetate）：溶解20.4g的三水乙酸钠于约40ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到50ml；④2％十二烷基硫酸钠（SDS）：称取1gSDS慢慢转移到约含40ml的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至50ml；⑤40%氢氧化钠（NaOH）：溶解40g氢氧化钠颗粒于约90ml水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至100ml。⑥1mol/L盐酸（HCl）：加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。⑦10mg/ml蛋白酶K（proteinaseK）：将100mg的蛋白酶k加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。⑧10mg/mlRnase（无DNase）（DNase－freeRNase）：即无DNA酶的核糖核酸酶溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中（pH5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris－HCl调pH至7.5，于-20℃贮存。（配制过程中要戴手套）；⑨1mol／LTris.HCl缓冲液（Tris-HClbufferpH8.0）：将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH（25℃下）加入46ml的浓盐酸，用蒸馏水调整终体积至1L；⑩6×凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝（bromophenolblue）：取60ml双蒸水，将250mg溴酚蓝溶解于其中；40%(W／V)蔗糖水溶液（sucroseinwater）：在上述溶液中加入40g蔗糖。另外：Ⅰ.100mL5×TBEpH8.0（电泳缓冲液）的配制：称取5.4gTris，2.75g硼酸加入2mL0.5mol／LEDTA(pH8.0)溶液中，再用蒸馏水补加到100mLⅡ.10ml组织匀浆液（装入10ml离心管中）的配制：100mmol／LNaCl：0.2ml（5MNaCl）25mmol／LEDTA(pH8．0)：0.5ml（0.5MEDTApH8．0)l0mmol／LTris.HCIpH8．0)：0.1ml（1MLTris.HCIpH8．0)加三蒸水:9.2mlⅢ.1ml酶解液（装入1.5ml离心管中）:200mmol／LNaCl：0.04ml（5MNaCl）50mmol／LEDTA(pH8．0)：0.1ml（0.5MEDTApH8．0)20mmol／LTris.HCl(pH8．0)：0.02ml（1MTris.HCIpH8．0)1％SDS：0.5ml（2％SDS）200μg／mL蛋白酶K：0.02ml（10mg／mL）加三蒸水:0.32mlⅣ.提取液1：平衡酚(pH8.0)：氯仿：异戊醇（25：24：1）即配即用,每管加500ul平衡酚(pH8.0)：250ul氯仿：240ul异戊醇：10ulⅤ.提取液2：氯仿：异戊醇（24：1）即配即用,每支试管加500ul氯仿：480ul异戊醇：20ulⅥ.TE缓冲液：5ml10mmol／LTris.HCl(pH8．0)：0.05ml（1MLTris.HCIpH8．0)1mmol／LEDTA(PH8．0)：0.01ml（0.5MEDTApH8．0)最后加三蒸水至4.94mL4．实验方法步骤及注意事项1）实验方法步骤：第一步操作：破碎、酶解细胞（过夜）(1)取0.2g鼠肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后置于2.0mL匀浆液中，用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在(冰浴操作，切勿将细胞破碎，可镜检观察)；(2)将组织细胞液移至1.5mL离心管中，5000r／min离心30—60s，(尽可能在低温下操作)，弃上清，若沉淀中血细胞较多，可再加入5倍于细胞体积的匀浆液洗一次；(3)沉淀加400uL无菌水迅速吹散，再加400uL酶解液，翻转混匀(动作一定要轻)55℃水浴处理12—18h；第二步操作：抽提DNA、乙醇沉淀纯化DNA(4)取20uLRNase加入1.5ml离心管内，使RNase至终浓度200μg／mL，37℃水浴1h；(5)将待抽提的样品等量分装在两支离心管内，各加入等体积①提取液酚／氯仿／异戊醇500ul（25：24：1现配先用），抽提(慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大)一次。4℃10min静置，然后10000r／min离心10min；(6)用扩口吸头移出含DNA的水相.(注意勿吸出界面中蛋白沉淀,有时如果DNA含量过高，水相在下层，实验时注意观察)；(7)然后加等体积②提取液:氯仿／异戊醇500ul（24：1现配现用）抽提，4℃静置10min，然后10000r／min离心10min(若界面或水相中蛋白含量多，可重复5，6，7操作)；(8)用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相，加1／10体积的NaAc，小心混匀(要充分)；(9)再向每管中加入2倍体积的无水乙醇，-20℃1-2h；(10)12000r／min离心15min，弃上清；(11)75％冷乙醇洗涤一次，12000r／min离心15min；(12)室温干燥(不要太干，否则DNA不易溶解)，加入50μLTE缓冲液。轻摇混匀，即可得到实验动物基因组DNA。存放于4℃；第三步操作：琼脂糖凝胶电泳检测DNA（AgaroseGelElectrophoresis）(13)制备琼脂糖凝胶（Preparationofthegel）：琼脂糖凝胶浓度为0.3％；(14)加入ＤＮＡ样品（LoadingDNAsamples）：DNAsamples16µl+Loadingbuffer4µl(15)电泳（Gel）：电压120V(16)电泳结果的拍照（Gelphotography）：通过紫外透射仪检测凝胶，然后获取图片。并将产物条带与已知分子量的标淮条带进行比较，便可以对合适分子量大小的产物进行鉴定。2）注意事项：（1）所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶；（2）所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制；（3）；用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性；（4）用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern杂交、PCR等）目的，如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化；（5）进行小鼠基因组DNA样品室温干燥时，不要太过于干燥，否则DNA不易溶解；（6）在用冰冷的生理盐水洗鼠肝之前，先要将玻璃匀浆器置于冰块中，待温度下降到一定程度再将鼠肝放入玻璃匀浆器，冰浴操作，但切勿将细胞破碎，整个过程尽可能在低温下操作；（7）用无菌水迅速吹散沉淀，加入酶解液后，翻转混匀时动作一定要轻；（8）抽提时慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大，离心后用扩口吸头移出含DNA的水相时，注意勿吸出界面中蛋白沉淀,有时如果DNA含量过高，水相在下层，实验时注意观察二．实验内容实验现象与结果：此次试验本小组所得紫外透射仪检测凝胶照片显示的天道如图所示：小白鼠基因组DNA的电泳条带图对实验现象、实验结果的分析及其结论：对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：小鼠基因组DNA的电泳条带都在同一条水平线上，但同时条带也有些暗淡，形状不佳。（2）对实验结果的分析及其结论：①本次实验抽提所得到的小白鼠肝脏细胞基因组DNA样品不纯，可能含有其他的一些杂质；②本次所用的凝胶浓度为0.3％，浓度过低，也有可能是导致电泳条带形状不佳的原