烧瓶振荡法动态测试抗菌性的研究

烧瓶振荡法动态测试抗菌性的研究

1抗菌纺织品的检测随着生活水平的提高，人们对纺织布依提出了各种功能要求。功能性纺织品的开发应用,成为纺织业发展的新热点,其中抗菌防臭产品的开发应用尤其迅速及广泛。除了日常生活所用的各种纺织品,如内衣、内裤、衬衫、T恤衫、毛巾、床上用品、袜子、鞋垫、羽绒等以外,抗菌产品还被用于非穿着制品,如席子、汽车坐垫、空调滤网等,因而抗菌纺织品的检测显得颇有意义。我们曾比较过纺织品的两种检测方法(浸渍法AATCC-100和JISL1902),在此,就另一种方法———烧瓶振荡法加以讨论。烧瓶振荡法与浸渍法相对,主要为非溶出性纺织品而设计,由美国道康宁公司开发,被日本纤维制品卫生加工协会认定为SEK标记作为加工纤维制品中抗菌防臭效果的一种定量评价法。我国卫生部颁发的《消毒技术规范》(2002年版)中的“抗(抑)菌试验”、“振荡烧瓶试验”与其基本相同。美国测试与材料协会标准“ASTME-2149固着性抗菌剂抗菌性的动态测试法”也是一种烧瓶振荡试验方法。我们主要根据ASTME2149-01方法,用不同的振荡时间、不同培养时间接种细菌、不同营养水平的振荡液体进行了试验。另外还做了浸渍法与该法的比较试验。2试验设备和材料2.1设备设备压力蒸汽灭菌器;恒温培养箱;天平,精确度±0.01g;三角烧瓶,配盖;环标移液管;盐水瓶;酒精灯;单标移液管;接种环;玻璃双重皿。2.2营养乳剂:牛肉膏营养肉汤:牛肉浸膏,3g;蛋白胨,5g;氯化钠,5g;去离子水,1000mL。营养琼脂:牛肉浸膏,3g;蛋白胨,5g;氯化钠,5g;琼脂粉,15g;去离子水,1000mL。以上培养基自配或购买(上海疾病控制中心培养基室)。2.3缓冲区缓冲区0.02mol/L磷酸盐缓冲液,加入5g/L氯化钠。2.4非离子表面活性剂将以上营养肉汤和缓冲液以不同比例配合(含肉汤1%、5%、10%、20%、50%),在最终用于振摇的液体中,加入0.01%～0.02%非离子表面活性剂。2.5普通微生物中心金黄色葡萄球菌(ATCC№6538),购自中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心;肺炎杆菌(ATCC№4352),来自中国台湾食品工业发展研究所生物资源及保存研究中心。2.6示例涤纶抗菌纤维(其杀菌率达不到99%)及相应的未做抗菌加工的对照纤维,由上海合成纤维研究所提供。外检试样若干。3测试方法3.1材料与试样制备细菌用甘油冻存。甘油冻存菌种转种于营养肉汤于37℃培养18～24h;转划平板培养24～48h(在冰箱中保存不超过5天);取单个菌落接种于20mL营养肉汤,振摇培养(37℃、110r/min)18±1h。菌液浓度在1×109～2×109CFU/mL,用于抗菌测试。试样准备:本试验中用的试样主要为抗菌涤纶,试样用量2g,置于200mL三角烧瓶中,高压蒸汽灭菌。试验分组:振摇培养前(所谓“0”接触组):对照试样(未经抗菌加工)(B);振摇培养后(不加说明的为22～24h):待检试样(抗菌加工)(A),对照试样(未经抗菌加工)(C)。3.2菌落总数的测定在有试样的三角烧瓶中加入50±0.1mL营养肉汤缓冲液。“0”接触组,加液后,立即用力振摇1min,然后取1mL用琼脂平板法计算菌落总数。振摇培养组,待检试样和对照试样在振摇培养,温度37±0.2℃、振幅2.5～3cm、速度120r/min、振摇轨迹平行圆周或往复式、时间22～24h,然后取1mL用琼脂平板法计算菌落总数。3.3试验数据的计算3.3.1细菌浓度测定F为增殖值(F应大于1.5,否则试验重做);B为“0”小时接触后,未经抗菌加工对照试样瓶内的细菌浓度(CFU/mL);C为培养后,未经抗菌加工对照试样瓶内的细菌浓度。3.3.2计算的抗菌率和抗菌率式中:A为振摇培养后,待检试样瓶内的细菌浓度。3.3.3计算抗菌值抗菌活性值和抗菌值抗菌活性值的价值杀菌值=lgB-lgA(4)抑菌值=lgC-lgA(5)4结果与讨论4.1振摇培养的结果用三种时间振摇,即1h、5～6h、22～24h,结果见表1、表2。自表1和表2可看出,在振摇速度不快,其他条件相同情况下,振摇时间对试验结果有明显影响。振摇时间长杀菌率高,反之亦然。以上做的三种时间比较,样品振摇时,同时加温培养,其结果显示三种时间的结果是不同的。长时间振摇培养,可得到更高杀菌率。在标准ASTME2149中,关于振摇时间,直接写的是振摇1h,但也可以是更长时间(“达到测试人员所规定的其他接触时间……”),不加温。也就是说在振摇过程中,不希望细菌增殖。我们的参照浸渍法,允许细菌增殖,当经抗菌加工的样品(以下简称加工样品)振摇培养后,细菌数比接种菌数减少,或同样振摇培养时间内,未经加工的对照样品细菌增殖更多时,就能证明加工样品具有抗菌性。延长振摇时间有利于统一浸渍和振荡两种测试方法,除了细菌与试样接触方式不同(通过浸渍或振荡方式)外,其它方面大致相同。4.2抗菌活性对杀菌率和抑菌值的影响用振摇培养6h、17h和30h细菌试验,结果见表3。振摇培养6h与17h样本杀菌率有差异,结果有统计学意义,抑菌值的差异无统计学意义,抑菌值用对数值计算,数值差异大。30h振摇培养使杀菌率和抑菌值明显上升。细菌生长繁殖分为四期,迟缓期、对数增长期、稳定期和衰退期。在此四期中,细菌的强弱是不一样的。杀菌或抑菌是一个相对概念,细菌的强弱对测试结果可产生一定影响。衰弱的细菌可使样品显示较高抗菌性;强健的细菌显示较低抗菌性。为此,在一个实验室不同批次试验中,采用强弱相对一致的细菌试验,是使该实验室测试结果有可比性的重要措施。除了在此列出的试验外,我们还做过一些试验,也大致如表3的情况。用十几小时稳定期的细菌更现实一些,用5～6h对数期的细菌,操作比较繁琐,实际测试中不易做到。4.3营养对不同浓度下克氏原螯虾1%猪肉细菌增殖的影响以第一、5%在振摇液体里加入营养肉汤,使细菌增殖。为摸索合适的营养水平,用不同肉汤含量液体进行了试验,结果列于表4和表5。表4是三批试验汇总,表5为一批试验。从表4、5可看出抑菌值和增殖值都与肉汤含量成正相关关系。表4增殖值与肉汤含量相关系数(R值)是0.8321,抑菌值与肉汤含量R值为0.8211,抑菌值与增殖值呈高度正相关,R值为0.9870。但因取点少,R值未能通过T测试。以上数值是多次试验所得,有正相关关系是毫无疑问的。另外,杀菌值受营养水平影响不太大,若有影响可能是相反,营养高杀菌值低,营养低杀菌值反而高,对此还不能给出肯定性结论。含1%肉汤液体的细菌增殖数太低(增殖值<1.5,参考日本标准JISL1902),不能采用。太高的营养,没有必要(增加稀释液管数,增加工作量)。在日本标准JISL1902中,接种菌液,采用5%浓度肉汤。但在我们的试验中,10%浓度肉汤,偶尔会出现增殖值1.7的情况,为保证对照细菌增殖有效(增殖值>1.5)采用10%浓度肉汤更为妥当。固定一个合适的肉汤浓度,可以使不同批次试验的抑菌率(或抑菌值)具有可比性。4.4测试结果及分析用两种方法(改良ASTME2149和AATCC100)对应地测试十余种纺织品的抗菌性,以观察不同方法的测试结果是否一致。共对12种样品,用两种细菌(金黄色葡萄球菌ATCC№6538和肺炎杆菌ATCC№4352)进行了19次对应试验,结果见表6。19次测试中,符合率为94.7%,只有一次,肺炎杆菌,两种方法的结果相差很大(外检样本,无材料可重复)。比较两种方法杀菌率平均数的差异显著性,结果是:T值0.340<T(0.05,36)=2.028,P>0.05无统计学意义。两种方法杀菌率的相关性统计,相关系数R=0.91,此数字离1不远,因样本离散度太大,R值的T测验未通过,即二者的线性相关未能通过,估计增加样本数(即多测一些样品),可解决此问题。标准ASTME2149中认为,该法只适合于非溶出性纤维及其制品的测试,并且在标准的最后部分还列出样本溶出性测试方法。经我们试验,初步