碳点cdos在荧光中的应用

碳点cdos在荧光中的应用

1荧光点与cu2+作为重要的微结合物，如原始葡萄糖、半胱氨酸和高半胱氨酸是许多氨基酸和蛋白质的重要组成部分，它们在许多生物化学和病理学过程中起着重要作用[1.5]。氨基葡萄糖对维持细胞的氧化还原、氧化应激和细胞生长起到了重要作用，而谷胱甘醇的浓度也与许多疾病（如癌症和其他疾病）直接相关。半胱氨酸的缺乏会导致儿童生长缓慢、头发稀疏、水肿、困倦、肝肾疾病、肥胖、皮肤损害和削弱。人类血浆浓度的高半胱氨酸是评价年龄疾病和心血管疾病的指标。小分子基化合物在生理系统中的适当浓度对于许多细胞的功能和健康生活非常必要。因此，它可以快速、准确、选择性地检测生物系统中基化合物的浓度，对生物化学和临床化学产生重要影响。碳点是最近几年发展起来的一种荧光纳米材料[13~21],和传统的有机荧光染料相比,具有荧光强度高、光稳定性好、耐光漂白、发射波长和激发波长可调控等优点;同时,与量子点等已广泛使用的荧光纳米颗粒相比,又具有毒性低、生物相容性好、低分子量和小粒径等特点,在生物成像[17,22,23,24,25,26]等领域具有很好的应用前景.但是,荧光碳点在分析检测中的应用鲜有报道.我们发现,Cu2+可以有效地猝灭碳点的荧光;而当有谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸等重要的生物巯基化合物存在时,由于巯基化合物与Cu2+的络合作用,而使Cu2+从碳点的表面脱落下来,碳点的荧光又会恢复;且在一定浓度范围内,相对荧光强度与巯基化合物的浓度呈线性.基于此,我们成功地构建了检测生物巯基化合物的新方法(如图1),该方法操作简单、响应快速灵敏,为碳点在生化分析测定中的应用开创了新思路.2实验部分2.1实验用水和材料碳点以油烟为原料,按文献报道方法制备,透析纯化后使用,平均粒径为1.5nm.还原性谷胱甘肽(北京鼎国生物技术有限责任公司),半胱氨酸(上海康达氨基酸厂),高半胱氨酸(上海晶纯实业有限公司),新鲜人血清(西南大学校医院),实验用水均为Milli-Q-Plus系统所制的超纯水.F-4500型荧光分光光度计(日本日立公司),pHS-4C型酸度计(成都方舟科技开发公司).2.2生物基化合物cu2+和硫酸铜溶液相互作用的荧光测定研究Cu2+对碳点的猝灭作用时,50µL的碳点用一定量的磷酸盐缓冲溶液稀释,然后加入不同量的硫酸铜溶液,定容后测定荧光.在研究巯基化合物和Cu2+的相互作用时,一定浓度的硫酸铜溶液和50µL碳点溶液混合,然后加入一定量的生物巯基化合物,定容后测定荧光.在467nm激发下测定522nm处荧光强度,激发狭缝和发射狭缝均为10nm.3结果和讨论3.1cu2+和碳点荧光信号的无cu2+实验在实验中我们发现,Cu2+对碳点荧光的猝灭是一个快速的过程,在5min内猝灭效率即达到最大.Cu2+和碳点混合后,猝灭程度2h内保持不变.因此在以后的实验中,我们在Cu2+和碳点反应5min后进行荧光信号的记录,并且在2h内完成检测和记录.同时我们发现,随Cu2+浓度的增大,猝灭程度增大(如图2(a)),并符合Stern-Volmer方程(如图2(b)).其方程为I0/I=0.61+8.29×10-2CCu2+(R=0.9954),其中I0、I分别是无Cu2+和有Cu2+时碳点的荧光强度,C为Cu2+浓度.常见的金属离子不影响铜离子对碳点荧光的猝灭.3.2edta和碳点荧光的反应将谷胱甘肽加入碳点-Cu2+体系后,碳点的荧光明显恢复(如图3),从图4发现,碳点在反应前后,其结构几乎没有变化.实验pH条件下(pH5.0),碳点表面存在大量-COOH,实验条件下带负电荷,而Cu2+则带正电荷,两者之间可以通过电荷作用和络合作用结合,通过电荷转移作用导致碳点荧光猝灭.Cu2+可以和谷胱甘肽等巯基化合物作用,生成稳定络合物,而使Cu2+脱离碳点表面,碳点的荧光被恢复.我们向碳点-Cu2+体系中加入EDTA,发现碳点荧光也可以恢复,且随着EDTA浓度的增大,碳点荧光恢复效率逐渐增大,也证实了络合作用是荧光恢复的原因.3.3碳点-cu2+体系的生物基化合物测定条件优化随谷胱甘肽加入量的增大,碳点-Cu2+体系的荧光也增强,因此碳点-Cu2+体系有望用于谷胱甘肽等生物巯基化合物的测定.为了优化测定条件,我们考察了碳点浓度、pH值、孵育时间对测定谷胱甘肽的影响.3.3.1谷胱甘肽对碳点荧光恢复效率的影响为优化碳点浓度,将不同浓度的碳点和5.0×10-5mol/LCu2+溶液混合,然后加入4.0×10-5mol/L谷胱甘肽.我们发现,当碳点浓度为1.0×10-5g/mL,加入谷胱甘肽后,碳点的荧光恢复效率最大(I2、I1分别是在碳点-Cu2+体系中存在谷胱甘肽和不存在谷胱甘肽时碳点的发光强度)(如图5).因此在以后的实验中,我们选取1.0×10-5g/mL的碳点做为实验中碳点的最佳浓度.3.3.2最佳基化合物基的确定按照实验方法将碳点(1.0×10-5g/mL)、Cu2+(5.0×10-5mol/L)和谷胱甘肽(4.0×10-5mol/L)混合均匀后,测定荧光光谱.我们发现在pH5.0时,碳点的荧光恢复效率最大,且荧光强度稳定(如图6).因此,在以后的实验中,我们选择pH5.0作为测定巯基化合物的最佳pH.3.3.3cu2+的静电吸引我们发现加入谷胱甘肽后,荧光强度迅速增大,1min内荧光强度即趋于稳定,且在15min内荧光强度相对不变(如图7).随着孵育时间的延长,碳点的荧光恢复效率逐渐降低,我们推断可能原因是碳点和Cu2+的静电结合能力较强,随着时间的延长,碳点对Cu2+有一个持续的静电吸引过程,使Cu2+和巯基化合物的络合作用降低,从而使碳点荧光的恢复效率逐渐降低;当碳点和Cu2+的静电结合作用与Cu2+和巯基化合物的络合作用达到平衡时,碳点的荧光恢复效率趋于不变.因此在后续研究中谷胱甘肽和碳点-Cu2+孵育1min后测定,并在15min内完成测定.在以谷胱甘肽为目标分析物的最佳实验条件下,我们在碳点-Cu2+体系中分别加入一系列不同浓度的谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸,发现随着这些巯基化合物浓度的增加,碳点的相对发光强度I2/I1逐渐增加,且在一定范围内分别与谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸的浓度成线性关系(如图8).碳点的相对发光强度I2/I1与谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸的浓度的线性回归方程及其检出限如表1所示.因此,此体系有望用于总生物巯基化合物的检测.3.4谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸、金属离子和氨基酸等物质干扰碳点-Cu2+体系可以高选择性的检测谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸等巯基化合物,而血清中常见金属离子和氨基酸等物质在试验条件下无干扰(如表2).3.5谷胱甘肽对小鼠血清中总基化合物的影响我们将碳点-Cu2+体系成功应用于人血清中总巯基化合物的检测.以谷胱甘肽为标准物质,通过标准加入法,测得5个成年人血清中的总巯基化合物的含量(如表3),这一实验结果同先前文献的实验结果4.87×1