去负荷及再负荷过程pi3kakgsk-3信号途径对骨骼肌蛋白分解及合成代谢的影响

去负荷及再负荷过程pi3kakgsk-3信号途径对骨骼肌蛋白分解及合成代谢的影响

随着人类航天业的发展和运动损伤恢复的研究，由于负荷去除，废用性萎缩越来越受到重视。骨骼肌废用性萎缩主要由于发生在肢体固定、疾病、瘫痪等制动去负荷情况下,宇航员在失重条件下症状尤其明显。去负荷导致的废用性肌萎缩主要体现在骨骼肌形态、结构、代谢方面:包括肌肉重量和体积减少,肌纤维直径(以横截面积计算)变小;收缩蛋白,尤其是肌球蛋白重链(myosinheavychain,MHC)的表型发生变化;分解代谢强于合成代谢。针对去负荷废用性肌萎缩而设计的恢复方式有多种,加入运动负荷是其中一种重要的方式。本文是以大鼠为研究对象,研究悬吊去负荷后,骨骼肌蛋白分解加强,发生废用性肌萎缩的骨骼肌再以不同方式的再负荷,探讨PI3K/Akt/GSK-3β信号蛋白表达的变化,这对于了解去负荷废用性肌萎缩的机理和选择对抗肌萎缩手段具有重要意义。1材料和方法1.1实验动物与设备雌性SD大鼠24只,SPF级,8周龄,体重(180~210)g。许可证号:SCXK(京)2002-0001,动物编号:0668277(北京维通利华实验动物技术有限公司)。标准饲料分笼饲养,自由饮食。室温(22±2)℃,相对湿度50%~70%,12h黑暗与光照交替。动物实验经由北京实验动物福利伦理委员会北京体育大学分会批准。大鼠适应性饲养3d后,按体重随机配对原则分4组:正常对照组(NC,n=6)、尾部悬吊去负荷组TS(n=6)、尾部悬吊去负荷14d+再负荷自由活动14d组NR(n=6)、尾部悬吊去负荷14d+再负荷离心运动14d组ER(n=6)。1.2实验和指标测试1.2.1去负荷建模及再负荷方案去负荷模型:采用废用性肌萎缩常用的尾部悬吊模型。TS、NR、ER组大鼠尾部悬吊,躯干与平地成25~30°,前肢着地,笼子为航天医学工程研究所特制的模拟失重研究用笼子,动物可在内自由活动和饮食。再负荷方案:解悬吊后,NR组自由活动。ER组离心运动2周,分两个阶段:第1周为缓冲适应期,第2周为低强度离心运动。缓冲适应期:离心运动组安静休息3d作为缓冲,第4d适应性水平跑15min,跑速为11m/min;第5d下坡跑15min,坡度为5%,跑速为11m/min;第6d下坡跑30min,坡度5%,跑速为11m/min。休息1d后进入第2周低强度有氧离心运动期:每天下坡跑,坡度5%,跑速16m/min,时间1h。离心训练参照Bedford根据最大摄氧量对应的强度,运动强度相当于58%左右的最大摄氧量水平。1.2.2测试样本采集与制备2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(45mg/kg)。NC组TS组实验14d取材,NR和ER组解悬吊按不同再负荷方式恢复14d取材,取右侧腓肠肌投入液氮中暂存,取材完成后转移至80℃冰箱。腓肠肌总蛋白含量测定:考马斯亮蓝法测定蛋白含量。腓肠肌组织液氮研磨,取200mg腓肠肌研磨成的粉末,以1:5(w/v)比例加入蛋白裂解液RIPA,在冰浴条件下,机械匀浆离心力为13000g,冰浴20min之后,4℃离心15min,提上清,-804℃保存备用。RIPAbuffer(RadioImmunoPrecipitationAssaybuffer):150mMsodiumchloride,1.0%TritonX-100,1.0%NP-40,1.0%sodiumdeoxycholate,0.1%SDS(sodiumdodecylsulphate),50MmTrispH8.0,1.0mMEDTA,1.0mMPMSF,1.0mMNaF4℃保存。1.2.3指标测试与方法免疫印迹半定量检测PI3K-p85、Akt、GSK3β和p-GSK3β的蛋白表达水平:按变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)-湿转-免疫检测步骤,半定量分析。丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺为29:1,分离胶浓度为10%,堆积胶浓度为4%,电泳仪(瑞典LKB),堆积胶中90V电泳,分离胶150V电泳直至溴酚蓝到电泳槽底部。电泳完毕,将具有目的条带的凝胶进行湿转,固相膜为PVDF(Millipore),孔径4.5μm。4℃封闭及孵育一抗:将载有目的蛋白的PVDF膜在TBST(3%BSA、mMTris-HCl、mMNaCl)缓冲液封闭:β-actin(1:2000,鼠单抗)、β-tubulin(1:1000,鼠单抗)、PI3K(1:500,兔多抗)、Akt(1:2000,鼠单抗)、GSK-3β(1:2000,鼠单抗)、p-GSK-3β(1:2000,兔多抗)(SantaCruz)。一抗4℃过夜孵育后,TBST摇床洗膜3次,每次5min。二抗室温孵育1h,羊抗小鼠IgG-HRP(1:8000)、羊抗兔IgG-HRP(1:8000),TBST洗膜3次,每次5min。暗室曝光,ECL化学发光液孵育印迹膜,柯达胶片压片,显影定影,凝胶系统拍照后ImageJ图像处理分析蛋白条带积分光密度。1.2.4数据采集及统计学处理收集的数据用SPSS13.0统计软件进行处理,结果用平均值±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,两组间的比较用独立样本t检验,多组间的比较用方差分析。2结果2.1ts组总蛋白含量的变化去负荷14d后,大鼠腓肠肌的总蛋白含量显著下降。如表1所示,与NC组相比,TS组总蛋白含量显著性下降,p<0.05;再负荷14d,以自由活动及低强度有氧离心运动两种处理方式进行再负荷比较,NR组及ER组腓肠肌总蛋白含量上升,ER组比NR组含量略高,但两个组之间没有显著性差异。2.2pi3k蛋白表达PI3K/Akt白表达水平的变化去负荷14d,TS组PI3K-p85蛋白表达略有升高,PKB略有下降,与NC组相比没有显著性差异;在不同条件下再负荷14d,与NR组相比,ER组PI3K蛋白表达显著高于NR组,P<0.05;ER组Akt也高于NR组,但两组之间没有显著性差异。2.3再负荷对er组gsk-3蛋白表达的影响P-GSK-3β和GSK-3β蛋白表达水平的变化去负荷14d,P-GSK-3β和βGSK-3β蛋白表达与对照组没有显著性差异。在不同条件下再负荷14d,与NC组相比,NR组的P-GSK-3β表达减少,但没有显著性差异;而GSK-3β蛋白增加,也没有显著性差异。ER组的P-GSK-3β和GSK-3β蛋白表达与NR组的趋势相似,其中ER组的P-GSK3β与NC组相比,有显著性差异,P<0.05;而GSK-3β则显著增加P<0.05。NR组与ER组之间P-GSK-3β和βGSK-3β蛋白表达略有差别,但两者之间没有显著性差异。3负荷抗阻训练去负荷导致的骨骼肌废用性萎缩是失重引起的不良影响之一,不仅发展速度快(5~7d),且严重影响肌肉正常功能。由于去负荷或微重力作用下,肌肉受载荷刺激减少,肌肉质量丢失,肌力下降,收缩特性以及代谢特征都发生变化。去负荷的主要结果使蛋白质合成作用减弱,分解作用加强。这可能在悬吊期间,去负荷或微重力作用激发了细胞凋亡信号,从而导致了废用性肌萎缩有关。如Parco等2005年研究显示,大鼠悬吊14d后,腓肠肌湿重明显减轻,下降30%;腓肠肌湿重/体重比下降11%;凋亡的DNA片段含量增加119%;BaxmRNA增加73%,且Bax和Bcl-2蛋白水平明显增加,这充分表明,在悬吊期间,去负荷激发了与骨骼肌蛋白质降解信号,使蛋白质分解作用增加而合成代谢作用减弱,同时伴有肌细胞发生凋亡现象,导致废用性肌萎缩的发生。本研究显示,悬吊去负荷14d后,去负荷组大鼠腓肠肌的总蛋白含量显著性下降(P<0.05)。对于失重状态下宇航员的研究也证实,去负荷能使骨骼肌代谢加强,肌肉质量下降,Trappe等(2009)研究表明,宇航员经过6个月的国际空间站太空飞行,腓肠肌质量丢失10%±2%,比目鱼肌丢失15%±2%(P<0.05)。去负荷使肌肉蛋白合成率下降,分解率增加,同时伴有不同程度的肌细胞凋亡,最终导致骨骼肌发生费用性萎缩。去负荷使肌肉蛋白合成率下降,分解率增加。通过对抗废用性肌萎缩措施,通过抗阻训练诱导骨骼肌纤维产生肥大效应,激发骨骼肌蛋白合成信号,增强合成代谢作用,可能有效治疗或减慢骨骼肌萎缩。Adams等(2007)通过电刺激方法,结合等长收缩、向心收缩及离心收缩来防止废用性肌萎缩。这种复合式抗阻练习能有效刺激训练腿一侧的骨骼肌合成代谢增强,维持肌肉质量及肌纤维含量。经过负荷抗阻训练一侧的肌肉,合成代谢或肌原性标志物的总RNA和mRNA数量增加,翻译水平提高,如:IGF-1、myoferlin和procollagenIII-α-1;而参与调节骨骼肌大小的负调节的myostatin减少。同时,负荷抗阻模型还能刺激合成代谢信号活动的媒介物的活性,如p70S6激酶。这些研究表明,动静结合的负荷抗阻训练能有效刺激合成代谢/生肌调节机制,对抗早期的废用性萎缩。骨骼肌生长涉及多种不同过程,包括蛋白合成增殖分化、肌卫星融合以及肌肉特异性基因表达。目前在体育科研中研究运动对增强骨骼肌蛋白合成率的信号途径只要集中在IGF-I/PI3K/Akt/mTOR以及IGF-I/PI3K/Akt/GSK-3β信号途径,并且已经证明这个途径对维持肌肉体积大小、刺激肌肉肥大及抑制肌肉萎缩方面有重要作用。在研究IGF-I/PI3K/Akt途径对骨骼肌纤维生长的作用表明,通过在体电转染组成型活性的Akt-1或Akt-2一周,Akt-1过表达使转染肌纤维横截面积增大170%,Akt-2使肌纤维增大100%(P<0.001)。Akt-1或Akt-2的Ser473磷酸化作用增加2.5倍。此外,研究显示,还可以通过抑制GSK-3β来防止和治疗肌萎缩。用IGF-I抑制蛋白降解,至少部分地通过PI3K/Akt介导灭活GSK-3β活性有关。IGF-I能提高GSK-3磷酸化作用减弱GSK-3β激酶活性。特异性抑制PI3K,也能减弱IGF-I诱导-的GSK-3磷酸化作用。萎缩复原的骨骼肌中,灭活的GSK-3β与肌核生长以及生肌细胞分化相关联。这些研究说明,对抗去负荷废用性肌萎缩,可以通过激发细胞内IGF-I/Akt/mTOR以及IGF-I/Akt/GSK-3β信号途径协调作用来完成。本研究以14d去负荷悬吊为模型,以自由活动及低强度有氧训练比较对腓肠肌蛋白合成的影响,假设低强度有氧训练可能有效促进废用性肌萎缩恢复,增加骨骼肌蛋白合成率。研究结果显示,自然再负荷14d,以自由活动及低强度有氧离心运动两种处理方式进行再负荷比较,两种方式都能增加腓肠肌蛋白质含量,其中低强度有氧训练组比自由活动组总蛋白含量高,但两组之间没有显著性差异。这说明再负荷的重力作用能刺激腓肠肌的蛋白质合成,但低强度有氧运动的方式比自由活动的对刺激蛋白质合成的作用优势不是十分明显。此外,在去负荷条件下,PI3K、Akt、GSK-3β和P-GSK-3β与正常对照组没有明显变化;而在再负荷条件下,PI3K、Akt、GSK-3β和P-GSK-3β出现明显变化,其中低强度离心运动组与自由活动组相比较,PI3K显著性增多;Akt也增多,但没有显著性差异;P-GSK-3β显著性减少;GSK-3β显著性增多,说明GSK-3β活性减弱。这些实验结果表明,对去负荷导致的废用性萎缩模型的腓肠肌进行再负荷恢复过程中激发了PI3K/Akt/GSK-3β信号,腓肠肌蛋白合成增加,这也说明PI3K/Akt/GSK-3β信号可能参与了骨骼肌蛋白的合成作用。许多研究表明GSK-3β在心肌和骨骼肌生长中作为负调节因子。在萎缩复原的骨骼肌中,灭活的GSK-3β与肌核生长以及生肌细胞分化相关联。细胞培养的研究结果显示,IGF-I抑制蛋白降解至少部分地通过PI3K/Akt介导灭活GSK-3β。通过肌原细胞修饰的小鼠的胚胎成纤维细胞C2C12肌原细胞分化过程研究显示,缺少GSK-3β蛋白及活性导致加强肌管形成以及骨骼肌特异基因表达。抑制GSK-3β能恢复生肌细胞的分化。在给予IGF-I或LiCl抑制GSK-3活性,能刺激生肌细胞生长,增加肌管形成,肌酸激酶活性,troponinI促进子转活,并且上调MyoD、Myf-5、Myogenin等的成肌甚至因子的蛋白表达。此外,研究还证实,在骨骼肌中,胰岛素以及运动都能减少GSK-3β活性。运动刺激PI3K/Akt/GSK-3β信号影