高脂血症大鼠实验动物模型的建立

高脂血症大鼠实验动物模型的建立

近年来，随着人们生活水平的提高，高脂血症（hyperdima）和脂肪酸（fattier）的发病率逐年增加。大量的流行病学调查和研究均表明,高脂血症是导致脂肪肝的重要因素之一,同时脂肪肝患者血中甘油三酯(triglyceride,TG)和总胆固醇(totalcholesterol,TC)明显高于非脂肪肝患者,而且以TG增高为主要特征。高脂血症和高脂血症性脂肪肝的病因学、预防和治疗已经成为目前的研究热点,而动物模型(animalmodel)在上述研究中得到越来越广泛的应用。本研究通过改良脂肪乳剂的配方动态观察大鼠血脂的变化,在形成高脂血症模型的基础上,继续予以脂肪乳剂,形成高脂血症性脂肪肝模型。1材料和方法1.1试剂与试剂盒胆固醇(中国医药集团上海化学试剂公司,AR级,批号F20030410),脱氧胆酸钠(北京双旋微生物培养基制品厂,批号20030617),丙赛优(上海复星朝晖药业有限公司,批号:030505),吐温80(蚌埠化学试剂厂,符合药用标准,批号20030602),1-2丙二醇(淮南市化学试剂厂,AR级,批号20021020),猪油自制。TG、TC测定试剂盒(北京福瑞生物工程公司)。AST、ALT、MDA、SOD、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。1.2仪器和检测电子天平FA2004(上海精天天平厂),79HW-1恒温磁力搅拌器(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂),722紫外分光光度计(上海分析仪器厂制造),医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)。1.3实验动物及分组Spague-Dawlay(SD)大鼠30只,♀♂各半,体重180～200g,由安徽医科大学实验动物中心提供(皖医实动准第02号)。1.4水相的制作参照文献,加以改变。取猪油25g放在200ml的烧杯里,放在磁力搅拌器上加热,待温度升到100℃时,加入10g胆固醇,溶化,再加入1g丙赛优,充分搅匀,然后加入25ml吐温80,制成油相。同时在另一烧杯中加入30ml蒸馏水和1-2丙二醇20ml,放在电炉上加热至60℃,然后加入2g脱氧胆酸钠,充分搅拌直到完全溶解,制成水相。然后将水相加入油相,充分混匀,即制成脂肪乳剂。1.5模型2:血清和肝脏功能模型动物随机分为2组,模型组20只,对照组10只。模型组每天给予脂肪乳剂灌胃(10ml·kg-1),每天1次,其中10只14d,其余的21d。对照组等量蒸馏水灌胃,方法同模型组。实验1wk后每组断尾取血,2wk后从模型组随机处死10只,迅速取出血清和肝脏放置-70℃冰箱保存备用。其余10只和对照组相同仍然断尾取血。3wk后全部处死,迅速取出肝脏放置-70℃冰箱保存备用。1.6观察指标和方程式1.6.1一般情况下实验期间每周称体重1次,观察食欲行为、粪便、毛发及动物死亡情况;实验结束时处死动物后称量体重、肝脏湿重。1.6.2血清生化血清TG、TC、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测定按试剂盒规范操作。1.6.3tg、tc、mda、sod含量测定在相同部位取肝脏精确称取0.3g,在冰水中制成10%的匀浆,4℃4000r·min-1离心10min,提取上清液,用酶法测定TG、TC、MDA、SOD含量。1.6.4性程度判断标准HE染色,在光镜下观察肝脂肪变性和炎症活动情况。肝细胞脂肪变性程度判断标准见参考文献(++或++以上为脂肪肝)。炎症活动度计分标准参考1981年Knodell提出慢性肝炎组织学活动指数(HAI),并结合王泰龄等提出的慢性肝炎炎症活动度计分方案。1.7统计处理计量资料ˉx±sx¯±s表示,各组间实验数据的比较采用两样本均数的t检验;等级资料采用秩和检验。2结果2.1腹泻现象明显Tab1所示,实验前后模型组与对照组体重无明显差异,模型组有少数大鼠出现腹泻现象,在实验第19天模型组死亡1只。模型组肝指数(肝湿重/体重×100%)在第3周明显升高。2.2血清脂质变化Tab2所示,模型组TG和TC从第1周开始明显上升,第2～3周均继续升高。2.3血清中的alt、ast、sod和mdaTab3所示,模型组ALT第2周开始明显升高,第3周继续上升;AST,ALT、MDA第3周后则明显升高,而SOD则明显降低。2.4mda和sodTab4所示,模型组第2周MDA明显升高,而SOD则明显降低,且随着时间延长到第3周后MDA水平更高,SOD则更低。而TG则在第3周后才开始明显升高。2.5肝脏疾病的发生2.5.1肝脏体积增对照组肝脏无异常变化。模型组2wk时肝脏体积增大,包膜稍紧张,边缘圆钝;3wk后肝脏体积明显增大,包膜紧张,部分肝脏呈奶黄色,切面油腻。2.5.2慢性肝损伤和脂变红细胞微核试验光镜下,对照组大鼠肝脏基本无异常情况。模型组在2wk时有2只轻度脂肪变性,但都没有明显炎症、坏死。3wk后其余动物均出现程度不同的弥漫性肝细胞脂肪变性,并有炎症出现,少数出现坏死灶,但未见肝纤维化。脂变肝细胞极度肿胀,成圆形,体积较正常明显增加,胞质内充满大量脂肪空泡,酷似泡沫细胞,界限不清。详见Tab5,Fig1～3。3脂质代谢相关化合物mda高脂血症又称脂质代谢紊乱或异常,是导致脂肪肝、动脉粥样硬化(aserosclerosis,AS)等多种疾病的因素。高血脂症的病因学、预防和治疗已经成为目前的研究热点,但至今药物治疗尚未明显突破,除了其它原因,理想的高血脂症动物模型制备可能也是制约该类药物发展的重要原因之一。在所有高血脂症的模型动物中,主要有先天性、转基因和化学物质诱导的三种实验性动物模型。前两种由于来源困难和代价昂贵,限制了其应用,而化学物质诱导的在国内应用最为广泛,尤其是高脂饲料喂养或灌胃形成的。本研究通过增加脂肪乳剂中猪油的含量,调整了脂肪乳的比例,克服了以前此模型TG不易升高且不能动态观察的缺点。灌胃1wk后,成功复制出大鼠高脂血症模型,比把胆固醇等添加在基础饲料中而形成的高脂血症模型时间缩短。此模型是经消化道给予,形成时间也相对较长,与人类因膳食结构改变而形成的高脂血症相似,对于研究环境因素对高血脂症形成的影响以及调血脂药物的开发应用具有很高的价值。而由蛋黄乳剂、环磷酰胺、Triton等通过静脉或腹腔注射形成的模型,是一次性诱发形成,虽然也可以归为环境因素造成的,但不符合人类高脂血症的形成特点,故一般只作为调血脂药物的筛选。脂肪肝以肝细胞内TG蓄积过多为主要病理改变。当肝细胞内脂质蓄积超过肝湿重的5%,或组织学上每单位面积见1/3以上的肝细胞脂变时,称为脂肪肝。高脂血症性脂肪肝是其中常见的一种,其主要发病机制与以下几点有关:①肝细胞转运TG能力下降;②低密度脂蛋白受体(lowdensitylipoproteinreceptor)合成减少或LDL和LDLR的亲和性减低,导致肝脏内胆固醇的沉积;③游离脂肪酸(freefattyacids,FFA)对肝细胞的损伤作用;④脂质代谢中的脂蛋白脂酶(lipoproteinlipase,LPL)和肝脂酶(hepaticlipase,HL)活性降低;⑤脂质过氧化作用。本研究发现,在形成高脂血症的基础上,继续给予脂肪乳剂,2wk后所有模型组均有不同程度的肝损害,出现了明显的炎症病灶,提示本研究所造成的高脂血症性脂肪肝模型是成功的。本研究发现模型组血清和肝匀浆丙二醛(malondialdehyde,MDA)均显著升高,目前认为MDA在肝组织脂肪变和肝损伤方面起了十分重要的作用:MDA可作用于核转录因子κB(NF-κB),使致炎因子基因表达、释放增强,并启动粘附因子的转录,包括白细胞介素-8(IL-8)、细胞间粘附因子-1(ICAM-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和选择素E等;MDA的两个功能基又可与线粒体的膜脂、膜蛋白NH2交联,形成希夫