玉米穗粒数杂种优势形成的分子机制研究

玉米穗粒数杂种优势形成的分子机制研究

优异优势是指遗传基础上的不同父母的混合，产生不同于1级的混合。它在生长潜力、抗逆性、繁殖力、适应性、产量和质量方面比家乡好，但其形成机制仍然是一个世纪的生物学问题。研究表明,表型变异的分子基础在于基因表达的变化。从基因组组成上看,杂交种的全部基因组来自2个亲本,并没有新的基因出现,但其性状并非亲本的简单组合这可能与来自亲本的基因在杂种一代的表达方式改变有关。玉米是我国播种面积最大的粮食作物,同时也是杂种优势研究与利用的模式植物。研究表明,在产量构成因素中,玉米杂交种在穗粒数上的优势最为明显。最近,Stupar等以B73和Mo17及其杂交种不成熟幼穗为材料,采用基因芯片技术研究发现,20%左右的基因在杂交种中为非加性表达,并且还检测到许多基因在亲本和杂交种中特异表达。采用同样的研究策略,Li等和Pea等以不同杂交组合为材料,分别分析小穗分化期和小花分化期的雌穗转录组差异表达谱,筛选出了一些差异表达基因,但是在蛋白水平上的研究迄今尚未见报道。强优势杂交种豫玉22曾经是黄淮海玉米区第一大推广种,在农业生产中发挥了重要作用。为了探讨该杂交组合产量杂种优势形成的遗传学基础,Tang等采用永久F2(IF2)设计方法研究,检测到13个QTL,包括3个产量QTL、7个穗长QTL、1个穗行数QTL及2个百粒重QTL,且所有QTL均表现超显性作用。本研究中,我们采用双向电泳技术,结合质谱鉴定方法,建立了杂交种与亲本雌穗花器官形成期的蛋白差异表达谱,并对差异蛋白进行了质谱鉴定,以期为解析玉米穗粒数杂种优势形成的分子机制提供蛋白水平的数据和资料。1材料和方法1.1剥取玉米穗,剥取玉米穗穗选用花器官形成期的豫玉22及其亲本综3、87-1的雌穗。用锋利的刀片从植株叶腋处剥取带苞叶的玉米雌穗,放在平整的桌面上小心地剥取雌穗(长度2.5cm),把苞叶去除干净。将幼穗取出,迅速包好放入液氮中,于-80℃保存。1.2提取和测定蛋白质采用SDS裂解buffer法提取杂蛋白样品。参照Bradford的方法测定蛋白质含量。1.3双向电泳参照Song等方法。1.4图像分析与编辑用Labscan(GEHealthcare,USA)进行图像扫描,分辨率为600dpi,并用Imagemaster2DPlatinumSoftwareVersion5.0(GEHealthcare,USA)进行图像分析。首先是蛋白点的自动检测,将参数smooth,minimumarea和saliency分别设置为:2、15、8,随后进行手动编辑(点的增减、切割、合并和轮廓修正);在软件自动均一化处理后,将所有胶与参比胶自动匹配,并手动修改。应用分析程序,分别根据蛋白点在线性胶条中的迁移率和与蛋白分子量Marker(购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所)的相对位置,确定其等电点和分子量。1.5内酶切参照Song等方法。1.6质量分析与醇酸签名质量分析的一致性使用AUTOFLEXIITOF-TOF(BrukerDaltonics,Germany)进行肽指纹图谱及二级质谱测定。2结果与分析2.1杂交与亲本间的差异表达模式采用高通量蛋白质双向电泳技术,建立了玉米未成熟雌穗花器官形成期的蛋白差异表达谱(图1)。选用的pH值分离范围为4~7,蛋白质分子量范围为7~175kD,每个基因型至少设立3个生物学重复,并且在每个基因型中95%的蛋白质点能够重复出现。对3个重复胶图蛋白点均一化后,通过t测验鉴定杂交种与双亲间的差异表达蛋白点。在雌穗花器官形成时期有114个蛋白点的表达差异达到显著水平(P<0.05),占该时期检测到的蛋白点总数(1290个)的8.84%,说明杂交种与亲本在蛋白质水平上发生了明显的表达差异。杂交种与亲本之间的蛋白差异表达模式表现为质和量的差异。质的差异模式可归纳为3种类型:(A)亲本特异表达,只在1个亲本表达,另1个亲本和杂交种均不表达;(B)杂种特异表达,基因仅在杂种F1中表达;(C)单亲沉默,只在1个亲本和杂交种表达,另1个亲本不表达。量的差异模式可顺序归纳为以下5种类型:(D)杂种上调表达,在杂交种和2个亲本都表达,但杂交种的表达量高于亲本;(E)杂种下调表达,在杂交种和2个亲本都表达,但杂交种的表达量低于亲本;(F)杂种偏高亲表达,在杂交种和亲本都表达,且杂交种表达量与高亲表达量差异不显著;(G)杂种偏低亲表达,在杂交种和亲本都表达,且杂交种表达量与低亲表达量差异不显著;(H)中亲表达,杂交种中的表达量介于双亲表达量之间,且与双亲的表达量差异显著(图2)。分析发现,本实验中,蛋白差异表现质差异的(39个)明显少于量差异的(75个)。其中单亲沉默模式(27个)和偏高亲模式(25个)的较多,其次为中亲表达(15个)、偏低亲表达(13个)、杂种上调表达(11个)、杂种下调表达(11个)及亲本特异表达模式(10个),而杂种特异的最少(2个)(表1)。2.2代谢类的分类从2-DE胶挖取全部差异表达蛋白点进行质谱鉴定,将已鉴定的104个蛋白点归为12个功能类别(见附表),其中代谢类最多(18个),其次为信号转导类(14个)、功能未知及假定蛋白类(14个)、抗病防御类(13个)、能量类(9个)、转录类(8个)、蛋白运输与储藏类(7个)、细胞生长与分裂类(6个)、转座子类(5个)、细胞结构类(6个)、蛋白质合成类(2个)及次生代谢类(2个)。3优势性状的遗传互作关于玉米产量杂种优势形成的遗传学基础,目前已经有许多研究报道。早在1992年,Stuber等首次利用QTL的方法,采用“DesignIII”设计对B73×Mo17组合进行了研究,分析认为超显性是玉米产量杂种优势的遗传学基础,这与此后Lu等以LH200×LH216组合为材料获得的研究结果相类似。后来,Frascaroli等以B73×H99组合为材料,采用“TTC”的设计方法,检测到17个穗粒数相关的QTL,其中表现为超显性、显性、部分显性和加性效应的位点数分别为10、5、1和1个。最近,Tang等以豫玉22组合为基本材料,利用“IF2”群体,共检测到13个QTL,包括3个产量QTL、7个穗长QTL、1个穗行数QTL及2个百粒重QTL,且所有QTL均表现超显性作用方式。另外,他们还检测到一些上位性互作位点,也可能起重要作用。有研究表明,1个超显性位点有可能分解为2个相斥相连锁的显性位点,造成假超显性现象。例如,以玉米自交系B73和Mo17杂交组合为基础材料检测到的1个超显性产量主效QTL,经过精细作图分析证明由2个较小的表现为显性效应的QTL组成。因此,显性和超显性等不同类型的遗传互作可能对玉米杂种优势形成都有贡献,并不是互作排斥的。本研究建立了强优势杂交种豫玉22及其亲本综3和87-1雌穗花器官形成期的蛋白差异表达谱,检测到114个差异表达蛋白点,包括单亲沉默、偏高亲、中亲表达、偏低亲、杂种上调、杂种下调、亲本特异和杂种特异等多种差异表达模式,其中单亲沉默、杂种偏高亲表达和杂种偏低亲等差异蛋白点可被解释为显性效应(65个),表现亲本特异表达、杂种特异表达、杂种上调表达和杂种下调表达的差异蛋白点可被解释为超显性效应(34个)。据此,我们认为显性和超显性效应可能均与玉米穗粒数杂种优势的形成有重要关系,这也与遗传上的研究结果相吻合。在蛋白差异表达谱分析的基础上,我们利用MALDITOFMS质谱技术鉴定了104个在杂交种与亲本之间差异表达的蛋白点,涉及代谢、信号转导、抗病防御、能量、转录、蛋白运输与储藏、细胞生长与分裂、转座子、细胞结构、蛋白质合成、次生代谢及功能未知和假定蛋白12个功能类别。尽管这些差异表达蛋白与玉米穗粒杂种优势形成的关系还不清楚,但是其中部分基因涉及的代谢途径在玉米雌穗发育过程中起重要作用,例如,6-磷酸海藻糖磷酸酶基因的突变导致玉米雌穗形态变化。本研究检测到两个海藻糖代谢基因在杂交种与亲本之间差异表达,即海藻糖合酶和6-磷酸海藻糖合酶,且均为单亲表达型。因此,这些基因的差异表达可能导致杂交种中海藻糖代谢途径的改变,进而影响玉米杂种优势的形成。在杂种优势机制研究上,已经定位了大量的重要性状杂种优势QTL,并明确亲本基因在杂交种中发生了明显的表达改变,需要进一步回答的问题是这些基因是如何互作并导致优势产生的,即杂种优势形成的遗传网络,其中表观遗传调控可能在其中起重要作用。例如,基因组水平上的研究结果显示,水稻、拟南芥和玉米等植物杂交种与亲本在DNA甲基化、染色质结构修饰和/或小分子RNA等表观遗传调控修饰状态上也发生了明显的改变[21,22,23,24,25,26]。拟南芥的生物量杂种优势与生物钟调控基因CCA和LHY启动子区域的组蛋白修饰状态改变有密切关系。最近研究发现,拟南芥表观遗传调控基因HEN1突变后导致苗期生物量杂种优势明显降低进一步说明表观遗传调控对杂种优势形成有重要的贡献。本研究检测到许多表现为非加性表达的蛋白点,但差异表达的分子调控机制是一个有待探讨的问题。比如,编码蛋白的基因在转录水平是否差异表达?表观遗传调控是否参与玉米穗粒数杂种优势的形成?我们相信对这些基因及其编码蛋白功能以及调控机制的深入研究,将有助于进一步阐明玉米穗粒数杂种优势形成的分子生物学基础。转座子和反转录转座子普遍存在于植物界,在植物基因和基因组进化过程中起重要作用,可引起染色体重排和基因的移码突变等。这些转座元件可作为调控序列,改变其他基因的表达方式。以小麦杂交种与亲本间叶片为材料的研究发现,编码转座酶和反转录转座子基因也发生了差异表达。本研究也发现,5个差异蛋白点(点154、点383、点408、点689和点1159)与转座酶或反转录转座子具有较高同源性,这可能是在杂合状态下,转座酶或者反转录转座子的活性受到激发,从而调控其他基因在杂交