高效毛细管电泳法分离检测饲料中氟喹诺酮类药物

高效毛细管电泳法分离检测饲料中氟喹诺酮类药物

氨基乙醇具有广泛的抗菌谱、较强的杀菌能力、允许使用的处方和较少的副作用（陈卓宇，2002）。因此被广泛应用于畜禽疾病的防治。但是超剂量或长期反复使用该药可引起中枢神经系统等不良反应(张俊丰和陈琳,2002)。人若长期食用含抗生素的畜禽产品,可产生耐药性及其他不良反应(李登赴,2008)。为了保障畜禽产品的质量安全和人类健康,已禁止喹诺酮类药物作为药物添加剂在商品饲料中添加(晓同,2001),但是滥用该类药物的情况依然存在。因此建立一种同时检测饲料中多种氟喹诺酮类药物的方法是十分必要的。目前饲料中喹诺酮类药物检测主要采用高效液相色谱法(中华人民共和国农业部,2008;施杏芬等,2008;满晨等,2005;潘葳等,2004)。但其分析时间长、运行成本较高。本研究将毛细管电泳的方法用于饲料中5种氟喹诺酮类药物的同时检测,通过对前处理方法、电泳条件等的研究,建立一种快速、准确、低成本的检测方法。1材料和方法1.1仪器、试药和仪器毛细管电泳仪(美国BECKMAN公司)P/ACETMMDQ,配有二极管阵列(PDA)检测器和色谱工作站;未涂层熔融石英毛细管内径75μm×65cm(购自河北永年与锐伴色谱器件有限公司);WH-2型微型旋涡混合仪(上海泸西分析仪器厂);SB25-120超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司);pHS-3C精密pH计(上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂);TGL-16C离心机(上海安亭科学仪器厂);Milli-Qplus纯水机等实验室常用设备。左氧氟沙星(LVFX)、恩诺沙星(ENR)、沙拉沙星(SAR)、环丙沙星(CIP)和诺氟沙星(NOR)标准对照品均由中国兽医药品监察所提供;柠檬酸钠、柠檬酸、四硼酸钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠和氨水为分析纯;乙腈为色谱纯;实验用水为超纯水。1.2溶液的制备1.2.1标准储备液的配制配制30mmol/L氢氧化钠溶液,准确称取恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星标准对照品各10.00mg,用30mmol/L氢氧化钠溶液配制成1.00mg/mL标准储备液。置于4℃冰箱密封保存。1.2.2标准工作液过滤储备液用30mmol/L氢氧化钠依次稀释成浓度为25、12.5、6.25、3.12μg/mL和1.56μg/mL的混合标准工作液,用0.22μm滤膜过滤后供分析。绘制标准曲线,用外标法定量。1.2.3不同ph值的柠柠檬酸钠溶液制备配制80mmol/L的柠檬酸和80mmol/L的柠檬酸钠溶液,按一定比例混合,调pH值分别为6.3、6.5、6.7、6.9,经0.22μm滤膜过滤,备用。1.2.4碱溶液配制提取液:乙腈-水(乙腈和纯水等体积混合);30mmol/L氢氧化钠溶液;2%氨水乙腈-水(2mL氨水用乙腈定容至100mL再与纯水等体积混合)。1.3毛细管的冲洗80mmol/L柠檬酸-80mmol/L柠檬酸钠缓冲液,pH6.5,0.5psi压力进样6s,分离电压为18kV、分离温度为22℃下分离,检测波长为274nm。两次进样间用0.1mol/LNaOH、超纯水和缓冲液分别冲洗毛细管2、3min和4min。毛细管在每次使用之前先用0.1mol/L氢氧化钠溶液、水、缓冲液冲洗各10min。1.4饲料样品的预处理称取饲料样品500g,粉碎,使之全部过0.28mm筛,充分混匀,贮存于磨口瓶中备用。准确称取0.5g的饲料样品(精确到0.001g)于具塞的离心管中,加入20mL的提取液,轻轻摇匀,在旋涡混匀器上剧烈混合3min,放气,摇匀,常温超声10min,冷却,常温超声10min,10000r/min离心10min,取上清液过0.22μm的滤膜,备用。2结果与讨论2.1电泳分离条件的优化2.1.1柠檬酸-柠柠檬酸钠缓冲液分离度的确定在其他条件相同的情况下,比较磷酸-硼砂缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液对分离度的影响,分析结果表明,磷酸-硼砂缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液分离效果较差,5组分不能完全分离;柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的分离效果较好。故实验选择柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液作为实验用的缓冲溶液。2.1.2缓冲液离子浓度对分离度的影响在其他条件相同的情况下采用不同离子浓度的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(70、75、80mmol/L和90mmol/L)进行分离。实验表明,缓冲液离子浓度对分离度有一定的影响。当离子浓度为70mmol/L和75mmol/L时,左氧氟沙星和诺氟沙星不能完全分离;当离子浓度为80mmol/L时,5组分能完全分离;但当离子浓度增大到90mmol/L时左氧氟沙星和诺氟沙星的分离度反而下降(见图1)。因此选择80mmol/L作为分离的最佳离子浓度。2.1.3缓冲液ph值的影响,各组分间的分离度的测定pH是影响分离的重要因素之一,在80mmol/L柠檬酸-80mmol/L柠檬酸钠缓冲液条件下,考察了pH为6.3、6.5、6.7、6.9对5组份分离度的影响。实验结果表明,随着缓冲液pH值的升高,左氧氟沙星和诺氟沙星、诺氟沙星和环丙沙星、恩诺沙星和沙拉沙星间的分离度随之增大,但是环丙沙星和恩诺沙星间的分离度却随之减小。当pH=6.5时,5组分之间的分离度均满足色谱分离的要求,且诺氟沙星和环丙沙星、恩诺沙星和沙拉沙星之间的分离度最大,但随后有所下降;当pH=6.9时,5组分间的分离度达不到分离要求(见图2)。因此选择缓冲液pH6.3、6.5、6.7为正交实验因子。2.1.4焦耳热中分离效率的变化由N=μappVLeff/2DL可知,工作电压越大,分离效率越高,但是工作电压越大,使工作电流也越大,焦耳热也越大,焦耳热引起的区带展宽增大,又会引起分离效率的下降(傅若农,1999)。本实验考察了16、18、20kV和22kV的电压对分离效果和迁移时间的影响,减小电压时会延长迁移时间,但当电压增加到22kV时,虽然迁移时间缩短,但是5种药物不能完全分离(图3)。综合考虑分度和迁移时间的因素选择16、18kV和20kV作为正交实验因子。2.1.5最佳的反应效率温度变化不仅影响分离的重现性,而且影响分离的效率(陈义,2000)。一般温度是在20~30℃之间进行选择的。综合考虑各方面的因素,选择20、22℃和25℃作为正交实验因子。2.1.6电泳条件对分离效果的影响本实验在之前实验的基础上通过正交实验建立最佳电泳分离方法。根据正交设计表L9(34)(邓勃,1995)设计了3因素3水平的正交实验,以相邻两种药物的分离度为指标,研究缓冲液pH(6.3、6.5、6.7),电压(16、18kV和20kV),温度(20、22℃和25℃)电泳条件对5种药物分离效果的影响(表1)。正交实验结果表明,除了实验5以外,其他实验组合中,5种药物不能同时完全分离,只有在实验5的电泳条件下,5种药物能够完全分离,即最佳的组合为:电泳缓冲液:80mmol/L柠檬酸-80mmol/L柠檬酸钠pH6.5、运行电压:18kV、运行温度:22℃(图4)。2.2方法学评价2.2.1毛细管电泳条件的测定将浓度为1.56、3.12、6.25、12.5μg/mL和25μg/mL的标准工作液,用正交实验得到的最佳毛细管电泳条件依次进行测定,以浓度(x)为横坐标,以相应峰面积(y)为纵坐标做回归分析。表2的结果表明,各浓度与其色谱峰面积呈良好的线性关系。2.2.2电泳条件的稳定性选择6.25μg/mL的5种混合标准样品溶液,利用最佳的电泳条件连续进样6次,考察各组分的迁移时间和校正峰面积的重复性。表3结果表明,5种药物的峰面积RSD在2.09%~5.89%,迁移时间的RSD在1.36%~1.69%。2.2.3回收率、精密度准确度的测定采用添加回收率法进行。实验在样品中分别添加浓度水平为20、25μg/g和100μg/g的5种药品的混合标样进行测定。回收率为实测添加量与标准添加量之比。表4结果表明,方法的平均回收率为84.42%~107.5%,RSD为1.33%~9.21%。回收率和精密度能够满足对5种药物的检测要求。2.3不同提取剂的提取效果本实验对比了乙腈-水、30mmol/L氢氧化钠、2%氨水乙腈-水3种不同的提取剂对饲料样品提取效果的影响(见图5)。从图5可以看出,乙腈-水处理的样品的杂质干扰较少,故最终选择乙腈-水作为提取剂。2.4饲料加标回收率的测定分别取雏鸡料、肉中鸡料、哺乳猪料和猪饲料添加不同浓度的5种药物的混合标样,用乙腈-水作为提取剂,按照1.4方