双峰驼乳中igg的分离纯化及免疫活性测定

双峰驼乳中igg的分离纯化及免疫活性测定

在干旱和半干旱地区，世界上大约有1580万骆驼。世界上许多地区的人把驼乳作为主要的饮食来源之一。据报道在良好饲养管理条件下一峰健康骆驼一个完整泌乳期内可产2000L驼乳。驼乳除了含有与牛乳一样的营养物质之外,还有比牛乳含量更丰富的生物活性成分,如溶菌酶、乳铁蛋白和免疫球蛋白等。大部分驼乳是以鲜奶或者以酸驼奶形式饮用,还可以经巴氏消毒、煮沸等灭菌方法处理,延长其保存期。但是上述处理方法对驼乳生物活性成分将带来不同程度地不利影响。热处理对于牛奶营养和活性成分的影响已加以广泛研究,但热处理对于驼乳的影响研究较少。本研究首次从内蒙古阿拉善双峰驼驼乳中分离纯化了IgG,并采用单向免疫扩散法测定了不同温度对驼乳IgG活性的影响,同时与牛乳IgG的热稳定性进行了比较研究,为驼乳的开发和商业化利用奠定提供试验依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1乳样健康双峰母驼10峰,购自内蒙古阿拉善盟,属阿拉善双峰驼。分别挤奶后混合乳样,经高速离心脱脂后置-20℃冰柜保存。1.1.2生物有限责任公司DEAE-52Whatman进口分装;丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺中国医学科学院生物医学工程研究所;考马斯亮蓝R250(BS05221)华美生物有限责任公司;丙三醇(2004429)天津北宏试剂厂;TrisTBD生物有限责任公司,Roche分装;过硫酸胺TBD生物有限责任公司;标准分子量蛋白(14.4～97.4ku)中国科学院上海生化研究所。1.2方法1.2.1硫酸铵-pb法将冷冻的脱脂初乳解冻并水浴至35℃后加凝乳酶,35℃保温凝乳。然后将凝乳破碎,于4800r/min离心20min,收集乳清。用等体积的0.01mol/LpH7.2的PB稀释乳清后缓慢加入饱和硫酸铵(在搅拌器中不断搅拌),使其饱和度达到40%,4℃放置4h,于4244r/min下,4℃离心15min,收集沉淀,并且将沉淀用0.01mol/LpH7.2的PB溶解至原始乳清体积,再进行第二次沉淀。将最终得到的沉淀用原乳清体积的0.01mol/LpH7.2的PB溶解,置透析袋中于4℃下对0.01mol/LpH7.2PB透析,直到透析液中检测不到SO42-为止(用1%的BaCl2不断检测),然后冷冻干燥,即为IgG的粗提取物。1.2.2提取igg的制备采用DEAE-52进行离子交换层析。将DEAE-52先用0.5mol/L的NaOH浸洗,再用去离子水洗至pH8左右,并用0.0175mol/LpH6.7PB平衡后上柱,装柱规格1.7cm×30cm。取2.5gIgG的粗提取物溶于20ml0.0175mol/LpH6.7PB中,平衡后上样,用0.0175mol/LpH6.7PB洗脱,待出现峰后进行收集。全部操作在4℃下进行,洗脱速度为60ml/h,280nm下自动检测并记录,将收集液冻干。1.2.3sds-gail，俄罗斯采用SDS还原电泳,浓缩胶为3.0%,分离胶为15.0%,15mA恒流电泳4～5h。用考马斯亮蓝染色。1.2.4加强免疫方案用弗氏完全佐剂乳化的驼IgG(2mg/ml)皮下和肌肉多点注射的方法免疫家兔,每点0.5ml,10d后接着用弗氏不完全佐剂乳化的驼IgG(1mg/ml)皮下和肌肉多点注入进行加强免疫,每点0.5ml。第30d时,同上次的方法进行加强免疫,第44d时检测效价达到1:32,采血置4℃冰箱自然凝固,于3500r/min离心10min,分离血清置-20℃保存。1.2.5水浴加热处理驼乳混合后,在4800r/min离心20min两次,去除脂肪。然后将乳样分成5等份。一份作为对照(未经热处理的驼乳),剩余的分别于65、75、85和100℃的水浴中加热30min,然后迅速降到35℃,然后在乳样中加凝乳酶于35℃保温凝乳。接着将凝乳破碎,于4800r/min离心20min,收集乳清。1.2.6兔抗蚤采用单向免疫扩散法测定驼乳IgG含量。首先用生理盐水配成1.5%琼脂,沸水浴溶化后,恒温于56℃水浴中备用。将兔抗驼IgG抗血清用生理盐水做10倍稀释,再与1.5%琼脂溶液等量混合,趁热浇于培养皿中,等完全凝固后打直径为3mm的小孔。待测样品稀释成不同稀释度,每孔加入10μl。将加好样的培养皿放入湿盒中,37℃温育24h后,取出,用精密度为0.02mm的游标卡尺测其沉淀环直径,求平均值,并根据标准曲线计算出IgG含量。2结果与分析2.1样品的纯化和回收率用40%饱和硫酸铵对乳清进行两次沉淀后,IgG粗提取物中IgG占蛋白含量的57.9%。再经离子交换层析柱纯化后收集的样品中IgG占蛋白含量的95.5%。最终回收率为17.1%(表1)。双峰驼初乳IgG粗提取物经DEAE-52离子交换层析图谱见图1,收集第一峰用SDS鉴定有四条分子量为51.2、45.6、40.7、28.4ku的蛋白带(如图2)。2.2温度对药代动力学的影响由图3电泳图中可以直观的看出,于65℃加热30min的条件下,驼乳白蛋白和IgG变化不大,但当温度提高到75℃和85℃时,驼乳白蛋白和IgG的条带逐渐变浅,当温度达到100℃时,驼乳白蛋白和IgG的条带几乎完全消失。图4显示了不同温度对于驼乳IgG活性的影响。可以看出温度对于驼乳和牛奶的影响不同。从表2可知65℃,加热30min驼乳IgG活性减少了的18.4%,于75℃和85℃加热30min,驼乳IgG活性分别减少了68.9%和86.6%,于100℃,加热30min,则驼乳IgG活性完全丧失。3关于双峰药igg的亚类及特异性研究有关分离纯化单峰驼血清或乳中IgG的研究报道较多[8～12],且多数采用盐析结合离子交换和分子筛等方法。Elagamy等报道,在分离纯化驼乳IgG时用40%的硫酸铵沉淀两次,获得的IgG回收率最佳。本研究发现,第一次用40%的硫酸铵沉淀乳清后的粗提物中IgG占蛋白总量的47.9%,IgG的回收率为28.9%;第二次用40%的硫酸铵沉淀后获得的粗提物中IgG占蛋白的57.9%,IgG的回收率为24.8%。由于牛IgG1和IgG2之间的电荷差异较大,因此认为用DEAE-Sephacel纯化牛IgG的亚类比纯化骆驼IgG的亚类容易。本研究中只测定总IgG,因此仍采用离子交换层析的方法纯化驼IgG。Ungar-Waron等用50%的硫酸铵盐析单峰驼血清,在0.0175mol/LpH6.3的PB缓冲溶液为洗脱液的条件下用离子交换层析法(DEAE-Sephacel)纯化驼IgG。经本实验摸索,在离子交换层析过程中,当洗脱液条件为0.0175mol/LpH6.7的PB时纯化效果更好。用该条件进行离子交换层析后最终纯化的样品中IgG含占蛋白总量的95.5%。IgG的最终回收率为17.1%。已有许多研究者对单峰驼的血清和初乳IgG的亚类及分子量进行了研究[8～12]。他们普遍认为单峰驼的IgG有三个亚类(IgG1、IgG2、IgG3),而后两者均无轻链。本研究从双峰驼初乳中分离到的IgG,经SDS鉴定发现与Azwai等从单峰驼初乳中分离纯化到的IgG很接近。经SDS分析本实验得到的IgG有四条带(如图2第6泳道)。分子量为51.2ku的蛋白带与牛IgG1的分子量(56～59ku)相近。分子量为28.4ku的蛋白带与牛IgG1的轻链的分子量相近。还有两条分子量分别为45.6ku和40.7ku的蛋白带。除此以外,本实验还发现从双峰驼血清中分离到的IgG与从初乳中分离到的IgG并无明显差异。要确定双峰驼IgG是否有三个亚类仍需进一步研究证明。另外,从电泳结果可看出双峰驼IgG与牛IgG有一定差异。有关双峰驼IgG与其他动物IgG抗原相似性已有报道,Azwai等认为尽管骆驼是反刍动物,它的免疫球蛋白与其他反刍动物有着较大差异。牛Ig的单克隆抗体不与骆驼Ig及其亚类产生交叉反应。然而,马IgGa和IgGb的单克隆抗体与骆驼IgG却有较强的特异性反应。本实验还用自行分离纯化的驼IgG免疫家兔,产生效价至少为1:32的抗双峰驼IgG抗血清。已达到用来定量检测双峰驼乳和血清中IgG含量的要求。热处理对于牛奶成分的影响已被广泛地研究,但热处理对于驼乳的影响研究较少。Wernery等全面地研究了热处理对驼乳脂肪、蛋白质、灰分、Zn、Fe、Ca、Cu、α-乳球蛋白、β-乳球蛋白、VA、VE、VB1、VB2、VB6、VD3、VC等成分的影响,并发现除了α-乳球蛋白和灰分之外,鲜驼乳与巴氏消毒(75℃,5s)过的驼乳之间的成分变化没有显著差异,并且实验证实驼乳中所检测的成分比牛乳中的热稳定性更高,这一发现对于驼乳的商业利用极其有利。Mohamed等研究了热处理对于驼乳酪蛋白的影响。Farah研究了热处理对于驼乳清蛋白的影响,也认为驼乳中的乳清蛋白的热稳定性明显高于牛乳。Elagamy等研究发现驼乳中的α-乳球蛋白,β-乳球蛋白和白蛋白比牛乳的相应蛋白的热稳定性高。Elagamy等研究的热处理对于驼乳乳清蛋白的影响中发现,驼乳中的乳清蛋白的热稳定性明显比牛乳中相应乳清蛋白的热稳定性高。其中驼乳乳清蛋白的热稳定顺序是:α-乳球蛋白>β-乳球蛋白>白蛋白。但从本研究的图1中只能定性的看出驼乳白蛋白的热变性情况。在65℃加热30min的条件下驼乳白蛋白无明显变化,但温度当升到75℃之后,驼乳白蛋白的条带与对照相比明显变浅。100℃加热30min之后,驼乳白蛋白几乎完全消失。从表1中可看出,阿拉善双峰驼驼乳中IgG含量明显高于Marnila等与Elagamy等报道的牛乳IgG含量。图2显示了不同温度对驼乳IgG活性的影响。可以看出温度对于驼乳和牛奶的影响不同。早期Larson等对于牛乳免疫球蛋白的热稳定性研究发现,在75℃,30min的条件下,牛乳免疫球蛋白的活性丧失了89%。Li-Chan等发现在62.7℃,30min的条件下,牛乳IgG的活性没有变化,但是Dhar等研究发现在71℃,加热处理9s后,IgG活性丧失了25%。本研究于65℃加热30min,驼乳IgG活性减少了的18.4%,而Elagamy报道的在65℃加热30min,驼乳和牛乳中IgG活性分别减少了5.4%和40%。当温度上升为75℃和85℃,加热30min后,本研究结果表明驼乳IgG活性分别