卷柏中穗花杉双黄酮的提取和分离纯化研究

卷柏中穗花杉双黄酮的提取和分离纯化研究

柏树及其下属植物广泛分布，品种丰富。全世界约有700余种,我国约有50余种,产于全国各地。主要分布在广东、广西、福建、台湾、浙江、江苏、江西、湖南、陕西,河北、山东、辽宁、吉林等地。春秋两季均可采集,药源丰富。卷柏很早就入药,药用全草,其性平、味微辛。古代医家主要将生卷柏用于活血化瘀,治疗跌打伤痛、腹痛、哮喘、月经闭止等症。炒卷柏(炭)用于止血,治疗月经过多、吐血、尿黄,研粉外敷以止刀伤出血等。卷柏经我国传统医学长期临床实践及现代药理验证,确认其有清热解毒、活血化瘀、止血抗癌、防癌治癌、抗炎、抗病毒、抗感染、抗过敏、镇痛、催眠、降血压、降血糖、增强人体免疫功能等功效。其临床上主要用于治疗闭经、吐血、尿血、便血、崩漏、脱肛、跌打损伤、腹痛、哮喘等。近年来,国内外学者对卷柏属植物的化学成分进行了大量的研究。从卷柏属植物中主要得到的是黄酮类化合物,而且其中以双黄酮类化学物居多。目前关于卷柏中穗花杉双黄酮的分离纯化方法报道较多,但是存在成本高、工艺繁琐、试剂耗费量大、分离时间长、操作复杂、能耗大等缺点。本文比较了卷柏中穗花杉双黄酮的提取方法,并采用两步沉淀和硅胶柱层析对其进行纯化,得到高纯度的穗花杉双黄酮产品,为其制备提供了一种工艺简单、可操作性强、成本低、收率高且不额外使用其他有毒试剂、适合工业化生产的方法。1材料和方法1.1试剂及仪器卷柏:河北安国药都制药集团有限公司。穗花杉双黄酮(Amentoflavone)对照品:北京汇科同创科学仪器有限公司;甲醇:色谱纯,迪马公司;水:超纯水,自制;其余试剂均为分析纯;三氟乙酸:色谱纯,默克公司;薄层层析预制硅胶板:HSGF254,烟台市化学工业研究所;硅胶:200~300目,青岛海洋化工厂;层析柱:500mm×18mm,上海锦华层析设备厂。LC-20AT岛津高效液相色谱仪:日本;BP211D电子分析天平:德国赛多利斯集团;TDL-5离心机:上海安亭科学仪器厂。1.2实验方法1.2.1高效液铬检测条件1.2.2配制成浓度准确称取3.94mg穗花杉双黄酮标准品溶于1mL甲醇溶液,配制成浓度为0.031、0.062、0.124、0.247、0.493、0.985mg/mL。依次进样分析。以对照品浓度X(mg/mL)与穗花杉双黄酮峰面积平均值作图,结果经回归分析。1.2.3提取方法和选择比较回流提取法、超声提取法、碱提酸沉法、微波提取法和半仿生提取法等5种提取方法。1.2.4穗花杉、双黄酮提取物的纯化由于卷柏提取物中含有较多杂质,同时考虑到穗花杉双黄酮较高的脂溶性及其易溶于乙醇的性质,探索将粗品溶解后调整合适的醇-水比例,进一步微调溶解液的极性,将与穗花杉双黄酮极性相差较大的杂质除去,对其进行初步的纯化。称取一定量卷柏粉末,提取。将提取液过滤浓缩,蒸干得固体粉末。称取等量的提取物粉末,溶于一系列醇浓度的溶液中,沉降一定的时间后,离心,分别收集上清液和沉淀。测定上清液中穗花杉双黄酮的含量和沉淀烘干至恒重,得到卷柏中穗花杉双黄酮提取溶液的沉淀曲线。1.2.5卷柏粗提物的分离纯化由薄层层析所得洗脱剂、洗脱剂配比进行卷柏粗提物硅胶柱层析的分离纯化,摸索洗脱顺序、洗脱体积等操作参数,进行卷柏粗提物的分离纯化。将硅胶柱层析洗脱所得的产品洗脱液接样收集。旋转蒸发仪蒸干后,称质量。精密称取一定质量的产品,用一定量甲醇溶解,进行高效液相色谱分析,计算纯度和回收率。2结果与讨论2.1精密度与回收率标准曲线为Y=1.787×107X-5.395×104,r2=0.9999。穗花杉双黄酮在0.031~0.985mg/mL范围内有良好的线性关系。精密度试验相对标准偏差(RSD)为0.54%,重复性试验RSD为0.74%,稳定性试验RSD为0.82%。加样回收率试验回收率平均值98.4%,RSD为0.94%。该方法与现有文献方法相比更经济、简便、快捷,采用梯度洗脱模式的方法缩短了分析时间,节省了溶剂耗费,有很好的分离效果。2.2最佳提取工艺的确定比较了回流提取法、超声提取法、碱提酸沉法、微波提取法和半仿生提取法,并筛选了提取溶剂,综合考虑提取率、能源耗费等因素,确定卷柏中穗花杉双黄酮的最佳提取工艺为提取温度75℃、料液比1∶12、提取时间为0.5h。提取次数为2次。80%乙醇水溶液回流提取的提取率为93.24%,其提取物的纯度为5.92%。重复性验证实验的结果表明此条件下的提取率重现性良好。2.3乙醇浓度对产品品质的影响称取100g卷柏粉末,75℃回流提取,提取液80%乙醇,料液比1∶12,提取2次,每次0.5h。将提取液过滤浓缩,蒸干得固体粉末。称取等量的提取物粉末,溶于乙醇浓度分别为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的溶液中。沉降一定的时间后,离心,分别收集上清液和沉淀。测定上清液中穗花杉双黄酮的含量和沉淀烘干至恒重,得到卷柏中穗花杉双黄酮提取溶液的沉淀曲线。由图1可以看出,随着溶液中乙醇浓度的降低,溶液中开始有沉淀生成,且生成的沉淀重量不断增加。与此同时,上清液中穗花杉双黄酮的含量则呈“S”型变化:随着溶液中乙醇浓度的降低,刚开始清液中目标产物的含量基本变化不大,在溶液乙醇浓度降到70%时上清液中穗花杉双黄酮的含量出现突变,而后迅速下降并在40%降至较低水平,随着乙醇浓度的进一步降低,清液中目标产物的含量基本维持不变。乙醇浓度从80%降至60%时,目标产物与溶液的极性相近,主要存在于清液中;而与溶液极性相差较大的极性杂质不断沉淀,对应得到的沉淀质量也在不断增加。在乙醇浓度从60%降至40%时,上清液中穗花杉双黄酮的含量骤降,此时有大量的穗花杉双黄酮作为沉淀沉降,并在乙醇浓度为40%沉降完全。在乙醇浓度从40%降至0%时,清液中的目标产物已大部分沉降到沉淀里,溶液中的非极性杂质与乙醇溶液的极性相差较大,作为沉淀不断沉降。因此选取乙醇浓度70%、65%、60%和50%、45%、40%对沉降目标产物的合适乙醇浓度进行进一步细化。结果发现,60%乙醇溶液能很好的沉降极性杂质且保证绝大部分的目标产物仍存在于清液里,45%乙醇溶液能使绝大部分目标产物沉降且使较多的非极性杂质存在于清液中。两步沉降的具体过程如下:卷柏回流提取液浓缩后加水,使其乙醇浓度为60%,沉降一定时间后过滤;滤液再次浓缩,加水使其乙醇浓度为45%,沉降一定时间后离心,弃上清液,所得沉淀即为目标产物。一次沉降目标产物的回收率为93.86%,二次沉降目标产物的回收率为95.46%;两步沉降的总回收率为88.66%,所得产品纯度为58.19%。卷柏回流提取的粗提物的纯度为5.92%,经两步沉淀工艺初步纯化后,其纯度可达58.19%,且两步沉淀工艺的回收率高达88.66%。可见两步沉淀工艺是初步纯化卷柏回流粗提物的有效步骤。该工艺利用溶液中目标产物与杂质极性的差异,操作方便、工艺简单、未使用其他有机溶剂,同时可兼顾纯度和回收率,得到较高纯度的目标产物。2.4洗脱剂配比优化根据穗花杉双黄酮的结构和性质,以氯仿、甲醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯及其不同配比为薄层展开剂,筛选硅胶柱层析的洗脱剂和配比。Hexane∶EtOAc体系对粗品完全不能展开。CHCl3∶MeOH体系目标产物和杂质有不同程度的分离,条带分隔较为明显,且CHCl3∶MeOH=12∶1时开始有目标产物被洗脱下来,对该洗脱剂配比进行进一步优化。MeOH体系则将目标产物和杂质全部洗脱。将CHCl3∶MeOH=12∶1配比的洗脱剂进一步细化筛选,其具体配比见表4。CHCl3∶MeOH洗脱剂配比为72∶3和72∶5时可较好的将目标产物与杂质分离,因此选用这两个配比的洗脱剂作为硅胶柱层析的洗脱剂。以卷柏粗提物2步沉淀工艺后的粗品干法上样,硅胶柱层析的洗脱剂、配比及洗脱顺序、洗脱体积等参数详见表5。CHCl3∶MeOH=72∶3体系主要洗脱弱极性的杂质,随着洗脱体系中甲醇比例的增高,目标产物被洗脱。目标产物被完全洗脱后,随着洗脱体系中甲醇比例的进一步增加,粗品中的极性杂质被洗脱下来。CHCl3∶MeOH体系洗脱剂配比8∶1时所得产品纯度可达97.16%,回收率可达50.74%。为了提高硅胶柱层析的回收率,可将CHCl3∶MeOH=5∶1和72∶5的洗脱液合并,蒸干后再用甲醇溶解,上样,重复上述洗脱过程,得到产品,进而提高硅胶柱层析过程中目标产物穗花杉双黄酮的回收率。3采用两次沉淀法测定穗花杉双黄酮产品纯度通过两步沉淀法和硅胶柱层析法对卷柏中穗花杉双黄酮进行了分离纯化。本方法工艺简单、可操作性强、成本低、回收率高且不使用其他的试剂,为其分离纯化提供了一条更优的方法。采用两次沉淀法使卷柏提取物的纯度由5.92%升高至58.1