高效液相色谱法同时测定穗花杉双黄酮和罗波斯塔-4-甲醚

高效液相色谱法同时测定穗花杉双黄酮和罗波斯塔-4-甲醚

abs里：对象、欧文、罗伯塔-4、迪米安、欧文、太阳和女人。我用菖蒲和玉米（4.6毫米）过滤，作为移动发泡剂。flow温度为1.0mlmin-1。这是shmadz。0.670-13.40g，反映良好的预反映性。99.8%和97.7%。0.85%和1.1%（n.6）。卷柏属植物分布广泛,全世界共有700余种,我国有70余种,分布于全国各地。翠云草为卷柏科卷柏属植物翠云草[Selaginellauncinata(Desv.)Spring.]的全草,主要分布于我国华东、中南、西南等地,其味微苦,性寒,全草在民间作药用,具有清热利湿、止咳止血、抗菌消炎、抗缺氧平喘以及抗肿瘤的作用。卷柏具活血止血之功效,用于经闭通经、癥瘕痞块、跌打损伤。卷柏属主要化学成分是以穗花杉双黄酮(amentoflavone)为代表的双黄酮类化合物。研究表明,穗花杉双黄酮具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、血管舒张作用等生理活性。罗波斯塔-4′-甲醚能显著地抑制淋巴瘤Raji和人呼吸道上皮Calu-1肿瘤细胞的增长。笔者建立了一种同时定量测定穗花杉双黄酮和罗波斯塔-4′-甲醚的分析方法。结果表明,该方法灵敏准确、重现性高,可为卷柏类药材中双黄酮类成分的含量测定提供参考。1仪器和试剂1.1仪器、检测方法Agilent1200型高效液相色谱仪(配备低压四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、ChemStations色谱工作站,美国安捷伦科技有限公司),UVProbe-2450紫外可见分光光度仪(日本岛津公司);BP211D电子天平(0.00001g,德国塞多利斯公司)。1.2对照品的计算穗花杉双黄酮(amentoflavone)对照品(自制,经HPLC检测,归一法计算纯度>99.0%),罗波斯塔-4′-甲醚(robustaflavone-4′-dimethylether)对照品(自制,经HPLC检测,归一法计算纯度>99.0%)。乙腈为色谱纯,水为纯净水并经0.45μm水系滤膜过滤,其余试剂为分析纯。翠云草药材分别于2008年采于湖南怀化和湖南永州,经厦门大学李政基教授鉴定为Selaginellauncinata(Desv.)Spring.,卷柏药材于2009年购于长沙佰佳中药饮片有限责任公司,经中南大学李劲平副教授鉴定为Selaginella.。2方法和结果2.1检测条件及柱温度色谱柱为ShimadzuVP-ODS柱(4.6mm×150mm,5μm);流动相为乙腈-0.2%醋酸溶液,梯度洗脱,0~25min,乙腈25%~30%,25~30min,乙腈30%~40%,30~50min,乙腈40%~40%;流速为1.0mL·min-1;检测波长为338nm;柱温为30℃;进样量为15μL。2.2dmso-dmso的制备精密称取穗花杉双黄酮和罗波斯塔-4′-甲醚各30.00mg,置100mL容量瓶中,DMSO超声溶解并稀释至刻度,摇匀,经0.45μm微孔滤膜过滤,即得。2.3dmso提取精密称取药材粗粉(过20目筛)5.0g,每次加甲醇60mL,回流提取3次,每次60min,合并提取液,滤过,减压浓缩,转移至50mL容量瓶中,DMSO稀释至刻度,摇匀,即得。2.4穗花杉双黄酮和罗波斯塔-4-甲醚色谱结果及对照品分析精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,按“2.1”项下色谱条件进样,穗花杉双黄酮和罗波斯塔-4′-甲醚色谱理论塔板数均>10000,对称因子分别为0.965和0.989,与相邻杂质峰的分离度>1.5,对照品穗花杉双黄酮和罗波斯塔-4′-甲醚以及翠云草及卷柏色谱图见图1。2.5色谱条件的线性回归分别精密吸取“2.2”项下的对照品溶液2、4、6、8、10、20、40μL,按“2.1”项下色谱条件分别进样测定峰面积,以进样量X(μg)对色谱峰面积Y进行线性回归求得两者的线性方程分别为:穗花杉双黄酮:Y=505.7X+12.25(r=0.9999),线性范围为0.600~12.00μg;罗波斯塔-4′-甲醚:Y=439.4X+13.66(r=0.9999),线性范围为0.600~12.00μg。2.6添加溶液：添加溶液取穗花杉双黄酮对照品适量,精密称定,加甲醇制成浓度为0.114g·L-1的溶液,作为回收试验的对照品添加溶液。精密称取已知含量的翠云草叶(含穗花杉双黄酮和罗波斯塔-4′-甲醚分别为0.5340、7.107mg·g-1)粉末2.5g精密加入质量浓度为0.114g·L-1的穗花杉双黄酮对照品12.5mL和一定量的罗波斯塔-4′-甲醚对照品,按“2.3”项下方法制备,操作6份,计算回收率,结果见表1。2.7精密度与稳定性试验在“2.1”项色谱条件下,对同一份供试品溶液重复进样6次,分别测得穗花杉双黄酮和罗波斯塔-4′-甲醚的峰面积,计算RSD分别为0.78%和0.85%,表明精密度良好。取同一份供试品溶液依次在0、2、4、8、12、24、48h测定穗花杉双黄酮和罗波斯塔-4′-甲醚的峰面积,计算RSD分别为0.88%和0.97%,表明供试品溶液在室温下48h内稳定。取同一批翠云草药材,按“2.3”项下方法平行制备6份,测定穗花杉双黄酮和罗波斯塔-4′-甲醚的含量并计算RSD分别为0.99%和1.2%,表明该方法的重复性符合含量测定要求。2.8样品分析取各批次药材各2份,按“2.3”项下方法和“2.1”项下色谱条件测定峰面积积分值,外标法计算含量,结果见表2。3讨论3.1作为溶剂溶剂在供试品溶液制备的过程中,将甲醇提取液浓缩用DMSO定容,对照品溶液制备亦采用DMSO作为溶剂。对照品中的穗花衫双黄酮在甲醇和DMSO2种溶剂中均有较好的溶解性,罗波斯塔-4′-甲醚在甲醇中的溶解性较差,无法满足实验要求,因而在对照品和供试品溶液制备的过程中均选择DMSO作为溶剂是为了能够较好的溶解罗波斯塔-4′-甲醚,排除溶剂对实验的干扰。3.2药品中双黄酮含量测定从表1测定结果可以看出,2种同属植物之间既有一定联系,也存在较大的差异:在