胶束毛细管电泳法分离双黄酮类化合物

胶束毛细管电泳法分离双黄酮类化合物

大多数侧柏植物用于治疗肝炎、胆囊炎、肿瘤和缓慢性肾炎。它也被用作慢性支气管炎的报道，具有明显的效果。双黄酮类化合物是该属植物的主要有效化学成分。到目前为止,从该属植物中分离并鉴定出的双黄酮有十几种,这些双黄酮具有广泛的药理活性,如抗肿瘤细胞的细胞毒活性、解痉活性和抗流感病毒活性。因此,控制该属植物中双黄酮的含量十分重要。目前,分析双黄酮含量的方法主要是HPLC法,该方法不适合等度洗脱,且分离效果不理想。高效毛细管电泳(HPCE)作为一种现代分离模式具有分离柱效高、进样体积小和分析快速等特点,尤其是胶束毛细管电泳(MECC),它提供了一种独特的分离模式,并且具有分离中性化合物的能力。因此,选用MECC法进行双黄酮类成分的分析研究。1试剂与药品、试剂美国BeckmanP/ACE5500型毛细管电泳仪,DAD检测器,弹性石英毛细管柱(80cm×75μm,有效长度70cm,河北永年光导纤维厂)。胆酸钠(BR,上海科丰化学试剂有限公司)、十二烷基磺酸钠(SDS,纯度≥99.9%,德国Sena公司)及去氧胆酸钠(BR,上海科丰化学试剂有限公司)为生化试剂。其他如硼砂、磷酸二氢钠均为分析纯,乙腈为色谱纯。对照品穗花杉双黄酮(amentoflavone)、扁柏双黄酮(hinokiflavone)和银杏双黄酮(ginkegetin)为从中华卷柏中分得,并经IR、NMR及MS等谱学鉴定,HPLC峰面积归一化法测得纯度均大于98.5%。槲皮素(批号:100081-200406)来自中国药品生物制品检定所。实验供试品均在7～9月份采自河北、云南、福建等省,并由中国药品生物制品检定所张继副主任药师鉴定。实验中配制缓冲液和供试品溶液所用的水均为去离子水(MilliQ)。2柱温和检测波长进样方式,压力进样1.38×105Pa,9s;运行时间,35min;电压,20kV(恒压分析);柱温25℃;检测波长280nm;运行缓冲液为胆酸钠系统(10mmol·L-1硼酸钠,15mmol·L-1磷酸二氢钠,40mmol·L-1胆酸钠)-乙腈(3:2),pH=7.0。每次运行前毛细管用0.1mmol·L-1氢氧化钠溶液冲洗2min,去离子水冲洗2min,运行缓冲液冲洗2min。3浓缩液制备工艺称取供试品1g,加甲醇50mL,以索氏提取器回流提取5h,提取液浓缩至25mL。取5mL置10mL量瓶中,加内标溶液(0.5mg·mL-1的槲皮素甲醇液)1mL,以甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。此供试品溶液过0.45μm的微孔滤膜后注入毛细管电泳系统。4方法学的检验4.1对照品溶液的制备精密称取对照品穗花杉双黄酮、卷柏双黄酮和银杏双黄酮适量,用甲醇溶解制成上述3种成分浓度分别为0.2028,0.1680,0.1321mg·mL-1的混合储备液。分别精密吸取储备液1,2,4,6,8mL于10mL量瓶中,加0.503mg·mL-1的内标溶液(槲皮素甲醇溶液)0.5mL,加甲醇至刻度,摇匀,制成系列的对照品溶液,进样测定,测量峰面积值。对照品与内标峰面积比值Y和各对照品的浓度X(mg·mL-1)之间呈良好的线性关系,线性范围及回归方程见表1。4.2对照品溶液的制备精密量取含0.04056mg·mL-1穗花杉双黄酮、0.2016mg·mL-1卷柏双黄酮、0.0528mg·mL-1银杏双黄酮和0.0503mg·mL-1内标的对照品混合溶液,连续进样6次,记录峰面积。结果表明:穗花杉双黄酮、卷柏双黄酮、银杏双黄酮与内标峰面积比值的RSD分别为4.1%,3.2%,3.6%。4.3测定穗花杉、卷柏双黄酮和银杏双黄酮含量的测定取中华卷柏供试品6份,按“3”项下方法制备供试品溶液,在“2”项条件下测定穗花杉双黄酮、卷柏双黄酮和银杏双黄酮的含量。供试品含量的平均值分别为0.960%,0.500%,0.004%;RSD分别为4.6%,4.0%,13.4%。4.4对照品溶液配制取已知含量的中华卷柏供试品(穗花杉双黄酮0.90%,卷柏双黄酮0.501%,银杏双黄酮0.0035%)5份,每份0.2g,前3份分别加含2.273mg·mL-1穗花杉双黄酮和1.968mg·mL-1卷柏双黄酮的对照品混合溶液1mL,后2份分别加此对照品混合溶液2mL。按“3”项下方法制备所需溶液,在“2”项条件下测定穗花杉双黄酮、卷柏双黄酮的含量,计算回收率。穗花杉双黄酮低加入量的回收率(n=3)为96.34%(RSD=0.92%),高加入量的回收率(n=2)为97.34%(偏差为1.2%);卷柏双黄酮低加入量的回收率为101.8%(RSD=4.4%),高加入量的回收率(n=2)为98.50%(偏差为3.4%)。另取该供试品5份,每份0.5g,前3份分别加浓度为0.810mg·mL-1的银杏双黄酮对照品溶液1mL;后2份分别加此对照品溶液2mL。按“3”项下方法制备所需溶液,在“2”项条件下测定银杏双黄酮的含量,计算回收率。银杏双黄酮低加入量的回收率(n=3)为99.17%(RSD为3.3%),高加入量的回收率(n=2)为96.53%(偏差为1.9%)。4.5峰面积的测定取供试品溶液,按上述电泳条件于0,0.5,1,2,4,8h分别进样测定峰面积,穗花杉双黄酮、卷柏双黄酮和银杏双黄酮峰面积的RSD分别为3.7%,5.1%,4.7%。结果表明,3个组分的甲醇提取液在8h内稳定。5e含量测定取供试品1g,按“3”项下方法制备供试品溶液,在“2”项条件下测定,以内标法计算穗花杉双黄酮、卷柏双黄酮和银杏双黄酮的含量。各供试品的含量结果见表2。6讨论6.1去氧胆酸钠系统的分离和研磨双黄酮类化合物由于双黄酮类化合物具有强的疏水特性,用常规的毛细管电泳法分离比较困难。所以,选用MECC法进行研究。本文比较和优化了几种分离系统,包括SDS系统、胆酸钠系统和去氧胆酸钠系统。在SDS系统中,试验了不同浓度的SDS及不同比例的添加剂(如硼砂,磷酸二氢钠,Tris盐,β-环糊精等)和有机改进剂(如甲醇、乙醇、正丙醇及乙腈等),pH6～10。结果表明:SDS系统无法分离强疏水性的双黄酮类化合物,几个成分峰始终叠加在一起;在对去氧胆酸钠系统(40mmol·L-1去氧胆酸钠,10mol·L-1硼酸,pH=8.6,11%的甲醇)的实验中发现,这一系统对于分离双黄酮有一定的改善。胆酸钠系统分离效果最好。这可能与胆酸钠胶束的特殊结构有关,在水溶液中,常规的SDS胶束呈球状,而胆酸钠胶束呈螺旋状,此种胶束的疏水部分在胶束的外侧,亲水部分向内翻转。这种“内翻螺旋”结构具有许多色谱特性,除本身具有较强的识别特性外,还能承受高浓度的有机改进剂,这个特性对分析疏水性化合物有着特殊的意义。但这一体系受许多因素制约,如pH不能低于7.0,有机改进剂浓度不能过高等。参照有关文献,本实验选择的运行缓冲液为胆酸钠系统-乙腈。并对pH、表面活性剂胆酸钠的浓度以及有机改进剂乙腈的比例进行优化。6.2缓冲区缓冲区优化6.2.1ph对分离选择性的影响运行缓冲液的pH既可改变溶质的结构,使溶质电离或呈中性状态,又可改变电渗流的大小,所以,pH对CE分离有较大的影响,因此本文在保持其他条件不变的情况下,改变pH(pH用稀氢氧化钠溶液或稀盐酸溶液调节)以研究pH对分离选择性的影响,见图1。由图可见,不同pH条件下,各个双黄酮的迁移时间有很大变化,pH为7.0时,分离最理想,当pH大于7时,峰迁移时间加长,峰展宽。6.2.2胆酸钠浓度的选择在胆酸钠系统其他条件不变(10mmol·L-1硼砂,15mmol·L-1磷酸二氢钠,pH=7.0)的情况下调节胆酸钠浓度从10到50mmol·L-1来研究胆酸钠浓度对分离选择性的影响,结果见图2。随着胆酸钠浓度的升高,各溶质的迁移时间也加长,这是因为胆酸钠浓度的升高,也提高了水相中胶束的相比,导致了这些化合物迁移时间的加长。然而,当胆酸钠浓度达到50mmol·L-1时,各色谱峰发生了变形。所以,选择40mmol·L-1作为试验浓度。另外,与常规的SDS系统相反,在胆酸钠系统中,极性大的溶质后出峰,这可能与胆酸钠胶束的内翻结构与极性内核有关。6.2.3胆酸钠系统表面活性剂的相互作用有机改进剂对化合物分离有重要的影响,它能影响溶质在胶束相和水相中的分布;改变胶束化学平衡及影响水相-胶束相中改进剂、表面活性剂之间的相互作用。在胆酸钠系统中,胆酸钠胶束能相容高浓度的有机改进剂,这一点十分有利于强疏水性化学成分的分析。在保持其他条件不变的前提下,从10%到50%改变乙腈的比例来考察乙腈的量对分离度的影响,见图3。从图中可以看出,随着乙腈比例的升高,卷柏双黄酮和穗花杉双黄酮的迁移时间加长,而银杏双黄酮的迁移时间缩短。乙腈为40%时,3个双黄酮的分离最为理想。6.2.4胆酸钠系统-乙腈冲液的制备根据以上优化结果,参照有关文献,最终确定运行缓冲液为胆酸钠系统(10mmol·L-1硼砂,15mmol·L-1磷酸二氢钠,40mmol·L-1胆酸钠)-乙腈(3:2),pH=7.0。6.3样品提取工艺研究6.3.1供试品溶液的制备方法一:取药材粉末1g,以氯仿50mL作溶剂,索氏提取器回流提取4h,氯仿提取液蒸干,残渣加甲醇50mL溶解,作为第1份供试品溶液;氯仿提取后的药渣继续用甲醇50mL提取5h,提取液定容至50mL,作为第2份供试品溶液。方法二:取药材粉末1g,置于索氏提取器中,加甲醇50mL直接回流提取5h,提取液定容至50mL,作为第3份供试品溶液。取以上3种供试品溶液按“2”项条件分析。结果证明:第1份供试品溶液的电泳图基本为一基线,没有黄酮提出来,第2份供试品溶液和第3份供试品溶液的图谱基本一致,所以,实验选择供试品直接用甲醇提取,不需要脱脂。6.3.2样品的提取时间取供试品1g,置索氏提取器中,用甲醇50mL提取,于不同时间0.5,1,2,3,4,5,6h进行取样分析,结果供试品在5