反相高效液相色谱法测定垫状卷柏药材穗花杉双黄酮

反相高效液相色谱法测定垫状卷柏药材穗花杉双黄酮

柏树是科维托科的一种约700种植物。它分布在世界各地。中国约有50多种药物，25种药物已经被发现。《中国药典》2005年版收载为卷柏科卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring和垫状卷柏Selaginellapulvinate(Hook.EtGrev.)Maxim的干燥全草。其味辛,平,归肝、心经。用于经闭痛经,癥瘕痞块,跌打损伤。卷柏碳化淤止血,用于吐血、崩漏、便血、脱肛。穗花杉双黄酮(amentoflavone)是卷柏属植物中的一种特征化学成分,有文献报道穗花杉双黄酮及其衍生物可作为一类新的天然的人组织蛋白酶抑制剂。SamSikKang等报道amentoflavone对由过氧化和β淀粉状蛋白质引起的神经细胞毒性有很强的保护作用,可对神经退化性疾病如局部缺血性抽搐和阿尔滋海默症有很好的治疗作用。穗花杉双黄酮有很好的抗炎作用,E.R.Woo等通过研究发现amentoflavone的抗炎机制在于其抑制了细胞核因子NF-κB在巨噬细胞的活化,从而抑制了氧化氮合酶的诱导生成。高效液相色谱(HPLC)法已经广泛用于天然活性成分的分离和分析,中国药典(2005年版)还未见用HPLC法测定卷柏中穗花杉双黄酮的含量,文献中的报道也甚少,为更好地控制垫状卷柏药材及成药的质量,本研究对垫状卷柏中的主要成分穗花杉双黄酮进行了含量测定研究,为建立垫状卷柏药材及其制剂的标准提供参考。1机器、试剂和样品1.1气相色谱-质谱ass-vp分析岛津LC-2010A高效液相色谱仪,CLASS-VP色谱工作站,UV-2010A检测器,自动进样器,柱温箱,四元低压梯度泵。甲醇为色谱纯,水为高纯水,其余所用试剂均为分析纯。1.2测试剂穗花杉双黄酮标准品由本实验室自制,纯度为98%。垫状卷柏药材采于西藏,由本研究所生药室袁王俊博士鉴定。2重量测定2.1流动相0.1%磷酸PurospherstarRP-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液(65∶35),流速0.8mL/min,柱温25℃,检测波长337nm。理论塔板数按穗花杉双黄酮峰计算大于6000。2.2配制储备液精密称取穗花杉双黄酮对照品1.9mg,加甲醇定容至10mL,配制成0.19mg/mL的储备液。取1mL储备液稀释至5mL,配制成0.038mg/mL的工作液,作为对照品溶液。2.3特征参数分别精密吸取对照品溶液1、2、3、5、7、9μL注入高效液相色谱仪,保留时间值为20.45min。以穗花杉双黄酮进样量(μg)为横坐标(x),以穗花杉双黄酮峰面积为纵坐标(y),进行线性回归,得回归方程为y=4E+06x+86960,r=0.9999,表明穗花杉双黄酮在0.038~0.342μg与峰面积呈良好的线性关系。2.4成分配液样品溶液将干燥的垫状卷柏粉碎,过60目筛,精密称取0.030g置于10mL容量瓶中,加甲醇适量,冷浸过夜。超声40min,放冷,用甲醇定容至10mL,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得样品溶液。2.5精密度测试精密吸取同一对照品溶液10μL,重复进样5次,分别测定峰面积,峰面积RSD为0.31%,表明仪器精密度良好。2.6样品溶液的制备精密称取同一样品6份(每份0.030g),按样品溶液制备方法制备6份样品溶液。各进样10μL,测定峰面积,计算,平均质量分数为3.57mg/g,RSD为0.021%。表明本方法重现性好。2.7稳定性试验取同一样品溶液,每隔2h进样1次,测定并记录峰面积,计算。RSD为0.057%,表明样品溶液在10h内稳定性较好。2.8对照品溶液制备采用加样回收测定法。精密称取已知穗花杉双黄酮含量的同一份样品6份,每份加入0.038mg/mL对照品溶液1.0mL,按样品处理方法制备样品溶液,每次进样10μL,测定并计算。穗花杉双黄酮的平均回收率为101.2%,RSD为2.3%。2.9穗花杉双黄酮含量测定按样品溶液制备方法制备各样品溶液,按上述色谱条件进样10μL,记录并计算峰面积,得穗花杉双黄酮的含量为0.36%。测定色谱图见图1。3讨论3.1标准品溶液的制备取0.020g标准品置50mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,得0.4mg/mL标准品溶液。用紫外检测器连续在200~400nm范围内测定吸光度,根据结果我们确定了穗花杉双黄酮的检测波长为337nm。3.2样品的超声提取作者曾将样品分成两份,一份用甲醇冷浸24h后超声,一份不冷浸直接用甲醇超声提取,结果显示冷浸24h后超声提取的样品穗花杉双黄酮含量较高,为3.57mg/g,而直接用甲醇超声提取的样品穗花杉双黄酮含量为2.85mg/g。另外,将甲醇冷浸24h后的样品分别超声25、40、60、90min,结果显示样品超声40min即已提取完全。故本实验用甲醇冷浸24h后超声40min的方法来提取。3.3色谱峰型的确定作者曾用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-2%乙酸水溶液等系统做流动相,发现甲醇-0.1%磷酸水溶液系统的色谱峰型较好。但穗花杉双黄