大豆异黄酮抑菌活性的研究

大豆异黄酮抑菌活性的研究

异黄酮主要是由豆科植物等体内合成的次生代谢产物，具有多种生理功能和生物活性。大豆中的异黄酮含量较高,其中以苷元形式存在的染料木黄酮和黄豆苷元的生物活性最强,因此研究大豆中异黄酮组分的生物活性成为热点。目前,大豆异黄酮抑菌活性的研究尤其引人注目,Verdrengh等研究表明大豆染料木黄酮具有抑制拓扑异构酶II和蛋白酪氨酸激酶(PTK)的作用,对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、巴氏链球菌(Streptococcuspasteurianus)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、幽门螺杆菌(HelicobacterPylori)具有明显的抑制作用,但不能抑制大肠杆菌(Escherichiacoli)。而黄豆苷元不能抑制拓扑异构酶II,因此抑菌能力较弱。Dastidar等证实大豆染料木黄酮的抑菌能力要优于黄豆苷元。本文研究了大豆异黄酮混合苷元提取物以及其中的两种主要生物活性成分染料木黄酮和黄豆苷元的抑菌活性,并对其最小抑菌浓度及抑菌活性的热稳定性进行了探讨,为大豆的深加工和开发新型天然防腐剂或抗菌剂提供依据。1材料和方法1.1试验材料1.1.1大豆异黄酮的提取大豆异黄酮混合水解苷元参照石冬冬等的方法制备,并稍作修改。供试大豆品种为垦丰5号,选用籽粒饱满的大豆,将其粉碎并过0.30mm筛,脱脂。准确称取预处理的豆粉10g加入200mL80%的乙醇于60℃水浴中搅拌提取9h,减压抽滤,将滤液用旋转蒸发仪于50℃蒸至没有溶剂流出,得大豆异黄酮浓缩液,多次重复此过程,将浓缩液合并。将得到的大豆异黄酮粗提物调节至pH4.5,然后加入CaCl2,其添加量为浓缩液中固形物含量的5%,在85℃下加热15min后,冷却,3000r·min-1离心10min,将固形物用低纯度(30%)的乙醇回溶,使其中的异黄酮尽量溶出,再离心,合并上清液。采用D4006大孔树脂柱层析法对大豆异黄酮进行纯化,上柱条件为:温度为25℃,流速为1.0mL·min-1,浓度为1.0g·L-1,20%与95%的乙醇梯度洗脱。通过上述方法提取的大豆异黄酮中97%以上都是以糖苷的形式存在,为了获得大豆异黄酮苷元需对糖苷型大豆异黄酮进行水解。水解采用黑曲霉β-葡萄糖苷酶水解法,底物浓度为1.6mmol·L-1,加酶量60U、温度45℃、水解时间90min。染料木黄酮和黄豆苷元购自SIGMA公司。用二甲基亚砜(DMSO)分别溶解大豆异黄酮混合苷元、染料木黄酮和黄豆苷元,配制成100mg·mL-1的溶液备用。1.1.2iacoli、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、沙门氏菌菌、沙门氏菌菌三大菌种供试菌种均为本实验室提供,包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussublilis)和沙门氏菌(Salmonellaspp.)。1.1.3培养基、培养基牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,琼脂20g(液体培养基不加琼脂),蒸馏水1000mL,pH7.0～7.2。1.2实验方法1.2.1菌种活化培养将供试菌种分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上,37℃培养24h进行活化。从活化后的斜面上挑取菌体接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中,37℃培养至对数生长期。分别吸取各对数生长期菌液500μL至一定量的无菌水中,调整配制成含菌数106CFU·mL-1的菌悬液。1.2.2抑菌圈直径测定采用滤纸片法测定异黄酮的抗菌效果。异黄酮溶液浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·mL-1,以滴加DMSO为空白对照,3次重复。用灭菌微量移液器吸取100μL菌悬液于牛肉膏蛋白胨培养基平板上,再用灭菌的涂布棒迅速将菌悬液涂抹均匀,制成含菌平板。在平板上分别放置4个直径为6mm的灭菌滤纸片,然后向滤纸片上滴加配制好的一定浓度的异黄酮溶液。置于37℃下培养24h后,用游标卡尺测定抑菌圈直径的大小,取其平均值。抑菌效果评定标准如下:抑菌圈直径小于或等于7mm时,规定为无抑菌作用或抑菌效果不明显,抑菌圈直径大于7mm时为有抑菌作用。1.2.3dmso对异黄酮的影响以金黄色葡萄球菌作为代表菌株,分别测定大豆异黄酮水解苷元、染料木黄酮及黄豆苷元的最小抑菌浓度。向96孔板中加入160μL液体培养基,再加入20μL金黄色葡萄球菌菌液(106CFU·mL-1)以及20μL不同浓度的异黄酮溶液,混匀,最终分别调整异黄酮终浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mg·mL-1。以加入DMSO为对照,37℃培养20h取出,滴加显色剂碘硝基四唑紫后再培养4h,然后观察颜色变化。为了考察大豆异黄酮在不同温度下的抑菌效果,进而评价其热稳定性,将异黄酮分别在40℃、80℃、100℃和121℃处理30min,然后再进行金黄色葡萄球菌的抑菌试验。2结果与讨论2.1抑菌效果的研究由表1可知,不同浓度和类型的异黄酮对微生物的抑制效果存在明显差异。从总体上看,各类异黄酮对多数微生物均具有一定的抑制效果,并随着浓度的增高抑制效果增强。不同类型异黄酮之间的抑菌效果差异明显,其中,大豆异黄酮水解苷元和染料木黄酮的抑菌效果较好,且前者略微优于后者,而黄豆苷元的抑菌效果很弱。这与Dastidar等的研究结果相似。从对不同微生物的抑制浓度来看,异黄酮对革兰氏阳性菌抑菌效果要优于革兰氏阴性菌。例如,染料木黄酮在较低浓度(0.2mg·mL-1)下就表现出对Staphylococcusaureus和Bacillussublilis的抑制作用,而对Escherichiacoli和Salmonellaspp.的抑制作用则在浓度达到0.6mg·mL-1后才显示出来。革兰氏阴性菌的细胞壁外侧含有一层脂多糖,它能够阻止疏水性的化合物进入到菌体细胞体内,这可能是导致降低抑菌效果的原因之一。本试验的供试微生物都是常见的致病菌和食品腐败菌,危害性较大,选择其作为研究对象具有一定的代表性。大豆异黄酮作为天然物质,具有广泛的生物学活性。大豆异黄酮经过水解后,其抑菌性得到增强,可以作为营养保健成分添加到其它产品中,或作为防腐剂添加到食品中,防止食品腐败变质和食物中毒及其它一些食源性疾病的发生。2.2温度对抑菌效果的影响选择抑制效果明显的金黄色葡萄球菌作为代表菌株,采用2倍稀释法测定了不同异黄酮的最小抑菌浓度,其结果如表2所示。由表2可以看出,大豆异黄酮水解苷元和染料木黄酮的抑菌效果明显优于黄豆苷元。在室温条件下,大豆异黄酮水解苷元和染料木黄酮对Staphylococcusaureus的最小抑菌浓度均为0.2mg·mL-1,而黄豆苷元则为0.8mg·mL-1。通过不同温度处理后异黄酮的抑菌效果的评价,可以看出温度对抑菌作用的影响及异黄酮的热稳定性。当在100℃及以上温度处理30min后,异黄酮水解苷元和黄豆苷元的抑菌效果有所下降,而染料木黄酮的热温度性较好,最小抑菌浓度没有发生变化。有研究表明大豆染料木黄酮可以抑制拓扑异构酶II和蛋白酪氨酸激酶(PTK),而黄豆苷元不能抑制拓扑异构酶II,这可能是导致不同类型异黄酮抑菌效果差异的主要原因。3最佳抑菌浓度的确定不同类型大豆异黄酮均对Staphylococcusaureus、Bacillussublilis、Escherichiacoli和Salmonellaspp.具有一定的抑制作用,且随着异黄酮浓度的升高抑制效