elisa技术在食品安全检测与分析中的应用

elisa技术在食品安全检测与分析中的应用

食品是人类生存和发展的物质基础，而食品安全问题是人类健康和经济生活的一个重要问题。作为WTO的新成员,我国与世界各国间的贸易往来日益增加,食品安全已经成为影响农业和食品工业竞争力的关键因素,并在某种程度上制约了我国农业产业结构和食品工业的战略性调整。目前,全球食品安全形势不容乐观,主要表现为食源性疾病、恶性食品污染不断上升和部分食品生产加工新技术与新工艺带来新的危害。其中有的病例不多,但病死率高、社会影响大,如猪肉中的瘦肉精(盐酸克伦特罗)残留;有的引起众多消费者急性发病乃至死亡,如肠出血性大肠杆菌O157:H7食物中毒;也有化学污染物造成广泛的食品污染,对人体健康具有长期和严重的潜在健康危害,如二噁英、农药和兽药残留的污染等。对于目前一些公认的重要食源性危害(如:农药残留、兽药残留、抗生素残留、重要有机物污染、生物毒素、食品添加剂和人兽共患疾病病原体等),在检测技术方面,不少尚属空白或不能够完善,不能满足食品安全控制的需要。因此,随着经济的发展,大多数国家开始对食品的安全性问题提出更高的要求,检测技术日益趋向于高技术化、系列化、速测化、便携化和易商品化发展。即便是在各种新型检测技术不断涌现的今天,运用免疫学和生物工程技术所建立的酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)技术,即ELISA,因其操作程序的规范化、简单化和检测的高灵敏性,仍然表现出其独特的优势并在农药残留、兽药残留、重要有机物污染、生物毒素、食品添加剂和人兽共患疾病病原体的快速检测和分析等食品安全性检测领域中有着广泛的发展前景。1elisa的生物检测技术ELISA技术自本世纪70年代出现开始,就因其高度的准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快以及费用低等优点,而在临床和生物疾病诊断与控制等领域中倍受重视,成为检验中最为广泛应用的方法之一。特别是随着蛋白质分离纯化技术和基因工程技术的不断发展,各种高纯度抗体、抗原和抗体复合物得以制备,单克隆抗体技术的应用,使得该诊断检测技术在特异性、灵敏度和客观性方面都有了大幅度的提高,并且在自动化免疫技术的推进之下进一步具有了精确的定量分析能力。由于ELISA的技术条件要求低、携带方便、常以试剂盒的形式出现且易商品化、操作简便和经济实惠,它已成为一种应用最为广泛和发展最为成熟的生物检测与分析技术。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。根据酶反应底物显色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定具有极高的灵敏度[1~4]。在应用中一般采用商品化的试剂盒进行测定,其特点是将抗原或抗体制成固相制剂,在与标本中抗体或抗原反应后,只需经过固相的洗涤,就可以达到抗原抗体复合物与其他物质的分离,简化了操作步骤。完整的ELISA试剂盒包含以下各组分:(1)包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂);(2)酶标记的抗原或抗体;(3)酶的底物;(4)阴性和阳性对照品(定性测定),参考标准品和控制血清(定量测定);(5)结合物及标本的稀释液;(6)洗涤液;(7)酶反应终止液。结合物为酶标记的抗体(或抗原),是ELISA中最关键的试剂。良好的结合物既保持了酶的催化活性,也保持了抗体(或抗原)的免疫活性。在ELISA中,常用的酶为辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)和碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,AP)。在少数商品ELISA试剂中,应用的酶有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。国产ELISA试剂一般都用HRP制备结合物。国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶(AP)作为标记酶。酶标记抗体的制备主要有戊二醛交联法和过碘酸盐氧化两种方法。酶结合物一般需经离子交换层析或分子筛分离纯化。随着ELISA在生物检测分析领域的广泛应用,根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,逐渐演变出了几种不同类型的检测方法:(1)双抗体夹心法测抗原或抗体;(2)间接法测抗体;(3)双位点一步法;(4)竞争法;(5)捕获法测IgM抗体;(6)ABS(avidinbiotinsystem)-ELISA法;(7)PCR-ELISA法;(8)斑点免疫酶结合试验(DIA)等。2定量分析复杂过程抗体抗原反应所特有的专一性和敏感性,使得食品在未经分离提取的情况下,即可进行定量定性分析,而一般的化学分析都必须经过分离提取等复杂过程。近年来,该项技术在食品安全性检测中正逐步得以推广应用,如天然毒性物、农药残留、微生物污染、食品成分和伪劣食品等方面的检测分析。2.1黄曲霉素aat真菌毒素(mycotoxin)是真菌产生的次级代谢产物,其中的十几种对人类危害较大,它们一般同时具有毒性强和污染频率高的特点。其中毒性最大、致癌能力最强的是黄曲霉毒素(AFT)。它在自然界中分布十分广泛,黄曲霉常常和其他多种微生物在一起,生长在粮食、油料作物的种子、各种食品和饲料中。自1977年抗黄曲霉素B1的单克隆问世,至今,几乎所有重要真菌毒素(如伏马毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯酮、展青霉素等)的ELISA检测方法均已建立。在对黄曲霉素B1的检测中,其检测AFTB1的线性范围0.25~5.0ng/ml,灵敏度为12.5Pg,整个测定过程仅为4h。另外该方法也正在被广泛地应用于各种藻类和贝类毒素的检测。2.2g/ml计算ELISA已成为许多国际权威分析机构(如AOAC)分析农药残留的首选方法。迄今为止,应用ELISA检测食品中的残留农药主要为除草剂、杀虫剂和杀菌剂。草甘膦的ELISA检出下限为0.07μg/ml。其它残留农药(Metolsulan,Fluroxypyr,Triclopyr和Benalaxyl等)的检测结果均与色谱法测定的结果一致。从目前来看,尽管ELISA检测限度还不能完全达到国外发达国家技术法规和限量标准的要求,而且抗体制备不易和不能同时完成多种农药残留检测等缺点,但是由于该技术具有样本前处理简单,纯化步骤少,大量样本分析时间短,适合于做成试剂盒现场筛选等优点,使其可在蔬菜产区、蔬菜批发市场和海关配备,工商人员可随身携带或建立固定的农药残留速测点,随时把残毒超标的蔬菜、水果杜绝在食用之前。2.3沙门氏菌检测结果准确可靠食品中的有害细菌数量达到一定数目,食用后会引起各种疾病。为了有效地控制其传播,就必须有快速和可靠的检测方法。目前有许多种方法,其中通过制备单克隆抗体分析食品中细菌的ELISA技术研究最多,检测结果准确可靠。例如对沙门氏菌最低检测量可达500CFU/g,仅需22h,比常规方法缩短了3~4d,与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。此外以ELISA技术为基础的全自动沙门氏菌检测系统,实现了整个过程的自动化,全程耗时仅为45min。其原理是将捕捉抗体包被到凹形金属片的内面,可以从前增菌液中吸附被检的沙门氏菌,对于该系统来说,需要做的只是加样。在对李斯特氏菌的快速检测中,利用三株针对单核细胞增生李斯特氏菌、无害李斯特氏菌和西里杰氏李斯特氏菌共同表位的单抗,以夹心ELISA法,在48h内,可从人工模拟肉中检测下限为5CFU/g样品。2.4elisa法检测肉品中的免疫活性ELISA在肉类食品品质检测中的应用主要包括加热终温判定分析和掺入异种肉的检测两个方面。肠道疾病的爆发和动物性食品有很大关系,而肉食品加热煮制不当是引起该疾病爆发的一个主要原因。在加热过程中一些成分的含量会降低,而一些产物的浓度会提高。当用蛋白质做指示剂时,可制备抗体,这种抗体对单一蛋白质的天然状态或变性状态均具有专一性,这样它就可以指示蛋白质在加热过程中变化。因而ELISA作为商业上快速判定分析肉品终温的一种方法。目前用的最多的是对乳酸脱氢酶(LDH)的免疫检测。其次是对掺入异种肉的检测,利用多克隆抗体对血清白蛋白的ELISA法,对鲜肉进行掺假检测。几种以单克隆抗体为基础的ELISA反应已得到应用。它们可以检测出1%~2%的掺假率。目前在商业上,ELISA已可以检测十多种动物肉,该方法已为USDA(UnitedStateDepartmentofAgriculture)使用。同时,ELISA技术也可以利用对热稳定的肌肉抗原来检测加热处理后的肉掺假情况。目前,该技术可以检测6种家畜熟肉制品,但是在部分肉类之间存在交叉反应,如猪肉同羊肉和鹿肉、鸡肉与火鸡肉。2.5实际检测生产中的应用利用ELISA技术测定动物性食品中有害残留成分只是近几年的事。随着研究的深入,由原样品的复杂处理和抽提发展为只需要高度纯化过程,加速了其在实际检测中的应用。特别是对猪肉、禽肉和水产品中重要禁用兽药残留(激素和兴奋剂)的检测。如瘦肉精酶联免疫检测法,基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定,不仅可作为一个定性筛选过程,也可以进一步进行定量测定。检测灵敏度可达到0.5×10-9,完全达到我国农业部目前的l×10-9监督检测标准。酶联免疫法作为克伦特罗残留量的筛选方法具有操作简便、准确快速的特点,适用于大量样品的测定,并可能成为国家标准检测方法。2.6elisa法检测bse的蛋白表达海绵状病毒(BSE)是牛的一种致死性神经系统疾病,它与人群发生变异型克雅氏病(VCJD)有关。对于该病病原,普遍认为是由一种蛋白质性的感染颗粒也称朊蛋白,是一种病理性细胞朊蛋白(PRPSC),由正常的细胞朊蛋白(PRPC)转变而来。蛋白酶核心位点的抗体应用于检测正常及BSE动物脑组织PRPC的含量,对于天然组织,两组差异很小,但经加热及异硫氰酸胍处理后,ELISA可将牛脑匀浆物中BSE特异性的PrPSc与PrPc区分开来,无明显临床症状的BSE感染动物可被检出,经对朊蛋白Western印迹法检测牛及羊朊病毒蛋白的灵敏度、特异性及可靠性进行分析,证明该方法是有效的。此外,在禽流感病毒检测方面,我国已完成了禽流感流行株的分离和鉴定、禽流感重组核蛋白诊断抗原的研制及应用,建立了禽流感免疫酶诊断方法和技术,已形成试剂盒生产能力。2.7金属硫蛋白hg金属硫蛋白遍存于自然界,细菌、植物、动物以及人类机体中,是一类对重金属离子有很强亲和力含丰富的半胱氨酸(约1/3),不含芳香族氨酸和组氨基酸的低分子量蛋白质。金属硫蛋白含有大量的巯基(-SH),能与Hg、Cd、Cu、Ag等重金属离子结合掩蔽金属的毒性,对细胞内的金属离子有重要的解毒作用。生物细胞,在环境受重金属污染(Cu、Hg、Cd、Pb、Zn与金属离子)的情况下,可被诱导合成出大量的金属硫蛋白,且在一定范围内成正比,是一项对金属污染具特异性的指标。用纯化的金属硫蛋白对兔进行免疫,兔抗血清纯化后并标记辣根过氧化酶,可实现对食品中重金属污染的超微量检测。2.8食品的生物活性测定ELISA技术同时可以用于食品中其它成分的检测,如:(1)检测某些特定的转移基因表达蛋白,以分析食品是否来自转基因生物或者含有转基因成分;(2)食品中营养素的测定,最小检出限可达0.05ng/g;(3)通过合成不同异黄酮的羟酸半抗原,分析植物中含量很低的雌激素;(4)也可用于检测食品加工过程中的酶(磷酸丙糖异构酶和转谷氨酰胺酶)含量的变化等。3食品安全性检测技术的必要性随着科学的发展与社会的进步,食品安全性问题越来越多地危害着人类的生活与生产。寻求能满足以下几个方面特点的食品快速检测与分析方法已成为食品安全性监测的新课题:(1)高灵敏度,可达到10亿万分之一,甚至更低;(2)高特异性;(3)宽适用范围,可测定各类食品;(4)低检测的费用;(5)易商品化。这些问题的解决无疑是食品安全与卫生事业的一次新革命。目前用于食品安全性检测的方法有很多[14~17],多为ELISA检测技术(ELISA检测技术对试剂的选择性高,很难同时分析多种成分;对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应;分析低分子量或不稳定的化合物有一定的困难等缺陷)、微生物学方法(Microbialassay:很难筛选到对同类抗生素的不同药敏性的特异菌株,且只能定性不能准确定量,易受其他抗菌药物的影响)、薄层色谱法(TLC:必须进行较为复杂的样品预处理和抽提,不能定量,灵敏度低)、气相色谱法和高效液相色谱法(GC&HPLC:需复杂的样品预处理,设备昂贵、检测费用高,难以推广使用)、PCR技术和核酸探针技术(在实验过程中易受到污染)等。这些方法虽各有其缺点和局限性,相比之下,在实际应用中只有ELISA检测技术才能在最大程度上同时满足食品安全性监测课题中所要求的上述五个必要条件。所以说,在食品卫生监测领域中ELISA检测技术泛必将成为引起世界各国的广泛重视和深入研究的食品快速检测与分析方法之一。4elisa在食品监测领域的应用基因工程和蛋白质工程的发展,为生物酶标分析技术提供了新的技术思路和模式,弥补了其在实际应用中存在的一些缺陷和技术局限性,使其具有更为广泛的检测范围、更高灵敏度与特异性和更精确的定量能力,从而使ELISA技术以新的姿态出现在食品监测领域中。系列化、标准化、商品化和多功能化的新型ELISA试剂盒产品不断涌现。结合近几年该免疫测定技术的研究动向对其发展趋势提出几点个人看法。4.1elisa检测通过基因工程技术可以快速、批量地生产出具有高度免疫原性的重组抗原,用来替代某些无法从天然材料中分离的抗原物质,进一步地扩大了ELISA检测分析范围