药物研究与发展：第04章 反义技术与反义药物

PAGE蓝色字为判断题内容反义技术与反义药物简介一、定义反义技术（antisenseapproach）是根据核酸杂交原理设计,选择性抑制特定基因表达为目的的新技术。包括反义DNA、反义RNA及核酶。反义治疗的基本机制是通过阻抑从DNA到mRNA的转录过程或从mRNA到蛋白质的翻译过程而阻断细胞中蛋白质的合成。反义DNA主要指反义寡核苷酸[1]，因更具药用价值而倍受重视。利用这一技术研制的药物称反义药物。寡脱氧核苷酸（oligodeoxynucleotide,ODN）是一段合成的DNA，由更小的单位即核酸组成的链，ODN可与基因组RNA或DNA或者基因组衍生的RNA互补。反义核酸技术发展简史1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构和碱基互补原则，开创了分子生物学的新纪元。1978年Zamecnik和Stephenson最先提出并尝试使用反义技术抑制基因表达，他们用针对罗氏肉瘤病毒（RSV）RNA的反义寡核苷酸片段抑制RSV复制及其RNA翻译获得成功。第一次证实了反义核酸封闭基因表达的可行性。1981年Tmizawah等在大肠杆菌中发现天然存在的反义RNA，明确地将这些反义RNA定义为反义基因。由于反义技术是从生命的最根本点──核酸的角度着眼，人们预感到它将对疾病的治疗有突破性进展。1990年美国的基因工程新闻把反义技术列为90年代十大热点生物技术之一。1992－1994年，反义技术在临床应用方面取得了重大进展，有六种反义药物进入了二期临床。1995年伯明翰大学的研究者首次报告了能口服的反义寡核苷酸药物。但在1995年以前，还没有一例关于反义核酸能降低细胞内相应靶蛋白和靶mRNA的定量资料，仅有关于推断性的反义作用机制的报道。1996年以后，随着对反义寡核苷酸作用机理的阐明，以及一些良好的临床结果的报道，人们对反义疗法又燃起了新的热情。1997年《自然》杂志指出反义药物将成为21世纪最前沿的五种治疗趋势之一。迄今为止，已有至少17种反义寡核苷酸进入临床试验。反义核酸技术的种类（一）反义RNA（1）反义RNA与mRNA杂交后阻断了其与核糖体的结合。在胞核内反义RNA影响转录的mRNA前体的加工和转运，因而抑制蛋白质的合成。（2）反义RNA借助了表达载体（质粒、病毒）并在细胞内转录产生，避免了在给药途径中易被核糖核酸酶（RNase）降解的缺点。（3）反义RNA在细胞内可持续表达，不存在半衰期问题。（4）由于操作的复杂性和安全性，故多不被采用。(二)核酶（1）一种具有酶催化活性的RNA。（2）核酶可催化RNA切割和RNA剪接反应。反义RNA与靶mRNA结合后，通过体内RNase的激活，使反义RNA分子与靶mRNA链一起分解。但核酶只催化靶mRNA的断裂，其本身并不受损，靶mRNA分子降解后，核酶随即解离下来，又可与其它的靶mRNA分子结合，继续发挥催化降解作用，因而比反义RNA的封闭阻断效率高得多。（三）反义寡核苷酸反义寡核苷酸是与含有蛋白质氨基酸序列信息的DNA或RNA链的某一段互补的短链寡核苷酸，能抑制DNA转录或mRNA翻译。简单的说就是根据核酸杂交原理设计，可以选择性抑制特定基因表达。第二节反义寡核苷酸一、反义寡核苷酸用于临床必须具备的条件（一）设计容易，而且多样根据所确定的靶mRNA的序列在转录、翻译过程的任何环节阶段都能设计相应的AON来加以阻止。（二）合成简单，速度快，可大量生产大规模制备、规模化生产是任何一种药物开发的基础，这一点对反义药物尤为重要。几年前反义药物的合成价格贵得惊人，使该类药物的临床前一系列研究无法进行。近年来，随着DNA大规模合成技术的开发及合成仪器的研制成功，反义药物的成本已降低到研究及药用可以接受的水平，从而加速了反义药物的临床前研究及临床过渡。虽然反义ODN是最成熟的反义药物，但至今尚未商品化。美国Isis制药公司采用快速筛选法，平均每周能鉴定出2个基因靶，只需6～9个月即可研制出一个反义化合物，并用于临床。将于近期提出Isis-2922的新药应用(NDA)申请。如果反义技术的进展导致寡核苷酸药物开发成功，实际上要求寡核苷酸的合成、纯化、鉴定等方面也取得进展。如Isis-2302的III期实验和商业性生产就要求批量生产数以千克计的产品。已有一些大规模合成的设备，如帕金-埃尔默公司(Perkin-Elmer)的设备,合成规模1mM。法玛西亚公司(PharmaciaBiotech)的OligoPilotII，合成规模0.1-4mM，每批可生产15.2g纯物质。OligoProcessSystem合成规模10-150mM，每批可生产450g纯物质，足供大规模临床实验需要。该公司计划开发的Oligomax，合成规模2M，每批可生产6-7kg纯物质，年生产能力达1吨以上。现在的DNA自动合成技术已经使AON容易合成。Pharmacia公司已经研制出合成反义DNA或反义RNA的自动合成仪。（三）AODN在体内可稳定存在（在AON的设计中的稳定性中详细介绍）（四）能进入靶细胞并保持有效浓度多种细胞系都能对AODN有效的吸收。因此AON对穿透细胞膜不成问题。AODN也可以以胞饮、内吞、受体介导等方式进入细胞。AODN发挥其反义作用，必须在细胞mRNA结合部位达到有效浓度。而AODN一般是多阴离子化合物，大多经过多种吞噬方式进入细胞发挥其反义作用。由于这是一种耗能过程，并且转运具有饱和性，要用很高的浓度才能有细胞水平观察到对目的基因的明显抑制作用。AODN的外排速度很快。可用化学修饰增加保持时间。尤其硫代型保持时间最长，有具有良好的穿膜和抗核酸酶的能力，是目前较为可取的一种。不经修饰的ODN不论在体液内还是细胞中都极易被降解，不能发挥其反义作用。因而多采用经化学修饰的ODN，以减少核酸酶对ODN的降解。对ODN化学修饰的方法主要针对三方面，即碱基修饰、核糖修饰、磷酸二酯键修饰。碱基修饰主要为杂环修饰、5－甲基胞嘧啶和二氨基嘌呤；核糖修饰主要为己糖、2ˊ－O－甲基取代核糖、环戊烷、α－构象核糖；磷酸二酯键修饰主要为硫代和甲基代修饰等。其中硫代寡核苷酸（phosphorothioate,PS－ODN）、混合骨架寡核苷酸（mixedbackboneoligonucleicacid,MBO）和多肽核酸（peptidenucleicacid,PNA）应用广泛，成为具有代表型的第一、二、三代ODN。（五）AON可识别并封闭作用于靶基因1.病毒类病毒是对人和动物危害极大的病原体，反义技术能特异性地抑制有害靶基因的表达。例如：人T淋巴细胞病毒、人免疫缺陷病菌毒、单纯疱疹病毒、流感病毒、脑炎病毒、SV40、罗氏肉瘤病毒、乙肝病毒、牛乳头瘤病毒和巨细胞病毒等。2.反义寡核苷酸对某些靶基因的抗增值效应（表4-1）。在体外培养细胞上已取得极大的成功，如：原癌基因c-met编码肝细胞生长因子（hepatocytegrowthfactor，HGF）受体，这是一种较强的表皮细胞有丝分裂原。因此，c-met基因产物可能与胃癌细胞的增殖或侵袭有关。与c-metmRNA互补的反义ODN可抑制癌细胞系中对HGF的应答，并且具有防止胃癌进一步发展的潜力。Bcl-2基因的过度表达可引起抗细胞凋亡作用，从而导致对化学药物的抗性。体外实验有力证明，与bcl-2mRNA互补的反义ODN具有下调bcl-2表达的作用。研究显示，bcl-2反义治疗可改善复发性非-Hodgkin淋巴瘤患者的病情。表4-1 反义寡核苷酸对某些靶基因的抗增殖效应靶基因细胞类型效应c-myb原代T淋巴细胞抑制增殖骨髓单核血细胞抑制血细胞生成原代大鼠平滑肌细胞抑制增殖c-met胃癌细胞抑制增殖和侵袭c-myc原代T淋巴细胞抑制殖增T细胞杂交瘤细胞抑制调亡原代人平滑肌细胞抑制增殖H-c-ras膀胱癌细胞抑制增殖HER-2/neu卵巢癌细胞抑制增殖bcr/abl慢性粒细胞性白血病细胞抑制集落形成bcl-2前B白血病细胞抑制细胞凋亡3.宿主基因类多药耐药基因、周期素（cyclin）、前胸腺素、T细胞受体、表皮生长因子（EGF）受体、β-球蛋白、磷脂酶A2、蛋白激酶C、白介素-1受体相关激酶等。4.细胞因子类：碱性成纤维细胞生长因子、白介素-2、白介素-1、IGF-1、粒巨噬细胞集落刺激因子、集落刺激因子-1等5.其他：氯霉素乙酰转移酶、TAR驱动的胎盘碱性磷酸酶、人乳头瘤病毒E2反应元件驱动的氯霉素乙酰转移酶。二、反义寡核苷酸的设计（一）专一性反义寡核苷酸必须具有高度的选择性，即专一性的识别DNA或RNA的特定序列并与之结合，这也是作为高效、安全的药物的基本要求。针对同一mRNA不同序列的反义寡核苷酸的作用效率相差甚远。所以mRNA的5’端、启动密码AUG周围或核糖体装配部位、3’端的非翻译区域，都可成为可选择的靶位。反义寡核苷酸可通过下述机制干扰基因的表达：（1）反义寡核苷酸与翻译起始位点杂交。这样可形成一种稳定的双链结构，从而阻碍了与搜寻起始密码子AUG的核糖体小亚基的结合，最终导致核糖体大亚基不能与其小亚基正确装配及起始翻译。在体外系统中已观察到反义寡核苷酸对翻译、剪接和核转运的抑制作用，并且这种抑制作用依赖于寡核苷酸的长度及其化学组成。从理论上讲，长约15个核苷酸的小寡核苷酸已具有抑制单个靶基因表达的特异性。过短则减少了其效应并增加了对细胞的非特异性抑制，过长不利于合成和修饰，同时影响进入细胞的能力。（2）反义寡核苷酸与RNA序列结合。这样可形成RNA-DNA双链，其中RNA部分可被RnaseH切割。一旦切割后，mRNA不能再进行翻译，并且迅速降解。通过这种机制进行的抑制作用是不可逆的，但缺点是非特异性。不依赖于Rnase的抑制作用具有更强的靶特异性。（二）稳定性反义寡核苷酸能够发挥其作用，必须满足以下条件：充分的细胞内浓度，较长的细胞内半衰期，具有对抗血浆、体液及细胞内核酸酶降解的能力。由于未修饰的反义寡核苷酸一般会立即被降解，为增加其稳定性，人们对它进行了大量的修饰。如：(1)改变立体构型。由天然的β型糖苷键改为α型。如：猴肾病毒α型比β型抗酶能力提高了30倍以上，说明α型是翻译的有力抑制剂。(2)化学修饰。即寡核苷酸磷酸骨架上的羟基被一些化学基团取代，如甲基（M）、氨基（NH）和硫(S)等，形成非离子型衍生物。由于M－和NH－ODN及α型异构体稳定性较好，也易进入细胞，但它们不能活化RNA酶H降解杂交双链中的mRNA，因而需要浓度较高，效果不尽如人意。由于磷酸二酯键是核酶的主要靶点，因此采用硫化试剂将ODN磷酸二酯键硫化成为PS-ODN类结构，是增强ODN稳定性的有效途径。PS-ODN是迄今研究最深入、应用最广泛的一类as-ODN。作为第一代as-ODN药物，PS-ODN具有良好的水溶性、稳定性及易于大量合成，基本能满足临床治疗的需要。与天然ODN相比，PS-ODN通过细胞内吞作用进入细胞内平衡所需时间更长，最终细胞内浓度也更高；其t1/2一般都大于24h[2]，极大地提高了对核酸酶的耐受能力。PS-ODN抑制基因的表达通过两种方式，即诱导RnaseH以降解目的mRNA或与目的mRNA形成杂交体而干扰mRNA的加工和翻译。其副作用主要来自其携带的负电荷和免疫原性，由于PS-ODN带有大量的负电荷，能与多种因子结合从而导致非特异效应。体外实验表明，PS-ODN及其核酸降解物能与血清蛋白、细胞表面受体结合，或者进入细胞内与某些碱性蛋白质或酶结合[3]。另外的研究还发现，PS-ODN及其核酸降解物中含有多个连续的CpG序列，会产生非序列特异性的抑制作用[4]。（三）通透性1．与多聚离子药物载体(PLL)连接由于PLL带正电荷，可与细胞膜非特异结合，所以可增加反义寡核苷酸透过细胞膜的效率。2．垂环修饰如胆固醇和磷脂与反义寡核苷酸结合后，对细胞的亲和力可增加8—10倍。3．脂质体包裹脂质体包裹修饰后的反义寡核苷酸不仅可以避免细胞外环境中核酸酶对其破坏作用，而且有利于通过血脑屏障，进入大脑。如：TGF、IGF就是治疗脑胶质瘤的反义药物。三、反义寡核苷酸的作用机理反义治疗的基本机制是通过阻抑从DNA到mRNA的转录过程或从mRNA到蛋白质的翻译过程而阻断细胞中蛋白质的合成。转运RNA（tRNA）就是一种反义或负链RNA，它可通过以下4种方式发挥作用：(1)与mRNA碱基配对，起始信息的翻译。(2)与mRNA碱基配对，延伸信息的翻译。(3)与rRNA碱基配对，定位三核苷酸反密码子区，以便与mRNA密码子产生最佳的杂交。(4)提供末端反密码子（terminalanticodon）（一种反义三核苷酸）以终止新生蛋白质序列。通过适当的载体进行转染以产生质粒衍生的反义mRNA可内源性地抑制翻译。各种亚类反义寡核苷酸外源性地抑制翻译。各种亚类反义物质如反义序列、反基因（antigene）序列和核酶可在不同位点阻断转录或翻译过程。具体来说，AON的作用机理如下：(1)物理阻断作用于mRNA5′端非翻译区，如核糖体结合位点，阻断rRNA与mRNA的结合，干扰相应基因的翻译。(2)激活核糖核酸酶H（RnaseH）反义寡核苷酸与mRNA结合，激活RNaseH，剪切杂交分子中的mRNA。(3)阻断mRNA拼接反义核酸与前mRNA外显子和内含子的连接区结合，抑制正常成熟mRNA的拼接。(4)改变mRNA的二级结构反义核酸与mRNA结合，mRNA二级结构发生改变,使RNA降解加速。(5)通过Hoogsteen碱基配对形式（T-A-T，C-G-C）反义核酸与双股DNA基因结合，形成三股螺旋结构，阻止靶基因复制或竞争抑制激活转录的蛋白与基因启动子结合，从而干扰基因转录(反基因技术)。(6)与单链DNA结合成双链结构以阻止靶基因的复制或转录。(7)与引物RNA结合，抑制DNA的复制。(8)作用于polyA形成位点，阻止mRNA的成熟及其向胞浆中的转运。(9)作用于mRNA5′端编码区，如起始密码AUG，阻止完整的RNA翻译，从而进一步阻止蛋白质的产生。第三节核酶核酶是指由RNA组成的酶。在天然情况下，核酶可催化RNA切割和RNA剪接反应。6个天然存在的核酶结构已得到鉴定，其中最著名的是锤头状和发夹状核酶。具有催化RNA切割的核酶可作为基因表达和病毒复制的抑制剂，目前已被开发用于基因治疗。一、给药方法由于核酶分子较大，故核酶不能像AODN一样通过受体介导的机制进入细胞，需通过特殊的方法导入。1.转染后内源性表达和外源性给药 载体构建物进入细胞后内源性表达核酶，但该法具有逆转录病毒载体的某些缺点如可能发生插入诱变。2.病毒载体逆转录病毒载体和腺病毒载体已用于核酶的释放。另一种方法是应用腺相关病毒（adeno-associatedvirus,AAV）载体，它能以非随机的方式整合到第19号染色体DNA中。3.携带多个核酶结构域的表达载体 这类多聚体酶造物似乎比相应的反义RNA或携带单个核酶结构域的转录子能更为有效而特异性地抑制氯霉素乙酰转移酶的表达。4.体内转录方法该法的缺点是限制了核酶发展为一种稳定的具有特定长度和催化功能的RNA分子的潜力。上述问题可以通过如下方法加以解决，即合成一个转录子，在其特定的反式作用核酶侧翼替换为另外两个顺式作用的锤头状或发夹状核酶。目前，由于缺乏有效的基因转移方法，这种方法尚不能用于治疗。5.核酶与易于进入细胞的分子耦联 由于进入细胞内质小泡（endocytoplasmicvesicle）后，核酶易被溶酶体酶所降解，故限制了该法的应用。6.脂质体介导核酶转移进入细胞 这种方法与ODN结合脂质体释放给药相似。脂质体囊的反义分子的抑制活性比非囊化分子高100倍。不经过脂质体囊化的OND和核酶仅通过离子相互作用结合在表面。因此，脂质体介导有利于ODN的进入，而不会随后因进入内吞小泡而易于被降解。一个理想的核酶表达载体应具有以下特征：①转录效率高；②可产生稳定的RNA；③转录的核酶不具有抑制性的二级结构；④核酶与底物定位于同一个亚细胞区室内。如果将核酶等RNA控制剂成功地输送到亚细胞区室中指定的靶点，必须弄清启动子策略以及特定预期位置的RNA信号。一种策略是将核酶包埋入用bonafide逆转录病毒转录子包装的假病毒转录子中，这样可能直接接近靶序列。Good等（1997）利用人U6启动子和不同量的U6RNA编码序列表达了小核酶、反义RNA以及抗HIV-RNA与蛋白质的RNA反聚体（aptamer）钓铒。结合RNA的Rev可有效地阻断HIV-1基因表达，然而利用上述元件表达的其他RNA则几乎没有作用。二、临床应用潜力与传统药物不同，核酶是破坏遗传信息流，而不抑制蛋白质功能。核酶靶向特定mRNA的治疗潜力非常巨大，是一种治疗疾病的新方法，尤其是一些因RNA异常表达所致的疾病如癌症和病毒感染的治疗。根据其催化特定的反应，目前正从完全随机的RNA池中选择新的核酶。在进行的基因转移或酶治疗中，这些核酶能取代其相应的蛋白质部分。核酶有望开发成为一种可用于治疗腺苷脱氨酶缺陷、Gaucher病以及其他一些因mRNA前体（premRNA）异常剪接所致遗传病的药物。（一）核酶作为抗病毒药物的潜力核酶能特异性地抑制病毒基因表达与复制，是一类极有希望的药物。它们不仅可以顺式而且还可以反式切割靶模体，这使得锤头状核酶成为抗病毒研究的前沿。由于病毒靶序列一般不存在于已感染的宿主细胞基因组中，因而，反义核酶不必为序列选择性的。与短的反义ODN或合成的核酶相比，长链反义RNA（30个碱基）或具有长反义臂的核酶并非处于劣势。当病毒处于潜伏期感染，其基因表达处于低水平时，采用核酶进行治疗可能更为有效，但该法难以处理完全活化的病毒基因表达和复制。下列病毒感染是核酶治疗潜在的靶子：(1)HIV-1感染；(2)乙型、丙型和丁型肝炎病毒感染；(3)A型流感病毒感染；(4)淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染；(5)牛白血病病毒感染；(6)Ⅰ型和Ⅱ型人嗜T淋巴细胞病毒（HTLV）感染。（二）核酶用于治疗HIV感染HIV-1为RNA基因组，在其病毒基因组和亚基因组RNA上含有多个潜在的核酶切割位点。由于病毒可迅速发生突变。故只抑制单个靶病毒的抗病毒药物往往对此束手无策。具有同时靶向许多不同位点以抑制HIV-1的多聚核酶已成为另一个重要的治疗方法。核酶可在病毒生活史中的两个部位上有效地抗HIV-1感染。第一个是感染后不久与前病毒DNA形成之前，此时所有的或部分病毒基因组仍以RNA形成存在。第二个是在已发生整合的前病毒形成之后，此时产生了经过剪接的和全长的转录本。特别值得注意的是，HIV-1能感染静止期的淋巴细胞，在这种细胞里已开始了前病毒DNA的合成，但是不完全的反转录。如果核酶存在于细胞质中，它可在T细胞活化前通过在上述第一步切割RNA以防止细胞持续受感染。研究显示，靶向5’UTR序列上某个位点的发夹状核酶的表达可使细胞中HIV前病毒DNA的形成降低50～100倍。当靶向tat中的保守位点并共享tat-rev外显子的锤头状核酶利用莫洛尼（Moloney）病毒载体LTR进行表达时，可保护培养细胞免受病毒感染至少达21天。这种抗tat和tat/rev核酶已通过转导进入衍生于造血CD34+干细胞的人骨髓，使多能干细胞分化成单核细胞系，并与HIV-1竞争。与只转导病毒载荷量相等的对照细胞相比，能表达核酶的细胞可免于病毒感染。Rossi（1995）报道了一种新的核酶-靶共定位策略，它利用RT的tRNALys3引物作为载体将核酶导入密切相关的HIV基因组RNA中，很可能进入病毒体（virion）本身。该策略是根据已知的HIVRT与细胞tRNALys3之间的相互作用而提出的，其中tRNALys3是所有哺乳动物慢病毒（lentivirus）均使用的引物。应用该法获得的结果小结如下：(1)tRNA-核酶选择性地与HIV逆转录酶结合，亲和力与合成的tRNALys3一致。(2)转染进入人胚细胞后，tRNA-核酶为PolⅢ转录。(3)tRNA-核酶可被输送到细胞质中，使之能够与逆转录酶结合。(4)当tRNA-核酶经短暂转当进入293细胞时，没有与内源性tRNALys3相当水平的Trna-核酶转录本。(5)tRNA-核酶基因与HIV-1DNA共转染进入293细胞后，与对照组织相比，病毒感染可降低4~21倍。目前正对艾滋病患者进行发夹状核酶的临床试验。（三）核酶与癌症治疗核酶是通过抑制mRNA翻译阻断蛋白质的合成。由于肿瘤形成的一个重要特征是产生能转化细胞的变异蛋白质，因此，核酶具有潜在的抗肿瘤作用。Kashani-Sabet和Scanlon（1995）对核酶在癌症基因治疗中的应用进行了专题评述。随着核酶介导抑制作用的成功报道，多名研究人员探讨了核酶用于癌症治疗的潜力。核酶介导的潜在的切割靶目标有：(1)融合转录本：bcr/abl、Ig/bcl2、alk/NPM和dek/can；(2)细胞调控基因的转录本：cdk2；(3)抗调亡基因的转录本：bcl-2和bcl-x；(4)静止细胞的（cytostatic）抗性基因转录本：MDR-1、MGMT和拓扑异构酶；(5)核转录因子：c-myc、N-myc、c-myb、c-foc和c-jun。研究发现，核酶在研究基因调控、抗病毒复制和灭活癌基因方面具有巨大潜力。核酶靶向技术显示，u-myc直接参与诱导调亡，并可在分子水平调控细胞凋亡。多种癌症模型研究显示，核酶优于反义治疗。然而，核酶介导癌治疗的靶子主要为癌基因，如在10%-15%的人类癌症中具有突变的G蛋白的ras家族，以及见于慢性髓性白血病的bcr-abl嵌合基因等。核酶若要成功地应用于临床尚有待于进一步的临床试验研究，同时还需要研究多种不同的给药系统，以确定一种最佳的癌症治疗方法。开发一种成功的可用于癌症基因治疗的核酶方案还需要符合多方面的要求，其中最重要的是选择合适的临床前（体内和体外）和临床模型系统，同时还应考虑开发适当的载体以确保设计的核酶正确进入靶细胞并表达。功能的设计与改造核酶基因治疗的一个重要目标是细胞内必须有足量的核酶，以保证结合和切割。一项通过核酶分子与靶RNA在细胞内共定位以提高有效作用水平的研究取得了令人振奋的结果。核酶与底物RNA示踪细胞生物学必将是一个极其重要的研究方向。第四节AODN的药效学评价[5-7]具不完全统计目前在动物体内评价的反义药物有10余种，其中抗肿瘤作用的7种，抗病毒作用的1种，其它如作用于心血管、代谢、免疫及细胞粘附系统的有4种。详见表4-2。动物体内的这些结果,已成为反义药物开发的基础。表4-2整体水平反义药物药效学评价结果[5，6，7]靶基因动物模型反义药

物种类长度

(nt)剂量及活性C-raf-1异植A549肺癌裸鼠硫代206mg/kg,i.v,1次/日.肿瘤生长及c-raf激酶mRNA呈剂量依赖性降低.PKC-aSK-1小鼠硫代20100mg/kg/200ml/日,i.p.,7日.肝脏PKC-amRNA下降90%.C-myc1.Em-c-myc转基因小鼠

2.CD-1裸鼠的人黑色素瘤异植物硫代

硫代15

18预防性治疗,20mg/kg/日,s.c.,6周.75%反义治疗鼠26周后仍未见肿瘤生长,而95%对照组鼠在16周时出现肿瘤.0.25,0.5,1mg/只/日,i.v.,8日,也用其它治疗方案.可见序列特异性的肿瘤生长抑制、肺癌转移数下降及寿命延长.C-myb1.K562细胞异植Scid小鼠

2.球囊扩张动脉损伤大鼠硫代

硫代24

18100mg/日,14日.反义治疗鼠存活时间是正义治疗鼠及未治疗鼠的3-8倍.损伤后即在动脉局部应用200mg反义药物,连续14日.损伤几乎完全恢复,但仅见于与药物接触的局部.NF-kB

(p65亚单位)1.HTLV-1Tax转基因小鼠成纤维瘤

2.裸鼠的皮下异植人纤维肉瘤或黑色素瘤3'端硫代+天然硫代21

18-24肿瘤建立后7日开始治疗,40mg/g.wt/每3日,i.p.,连续15日.8日后肿瘤明显缩小,15日后完全消失.1.4mg/只,二次/周,s.c.,或2.8mg/只,经泵给药14日,肿瘤细胞注射前或后72小时开始治疗.70%反义治疗鼠肿瘤明显缩小,上述方案的结果相同.IL-1受体小鼠中性白细胞刺激诱导IL-1硫代183nmol/日,s.c.,3日,IL-1注射前24小时开始治疗.中性白细胞活动度降低40%.黄体酮受体卵巢切除大鼠脊柱前凸行为诱导黄体酮天然18经直达腹侧正中下丘脑的双向导管单次脑内注射400ng药物.雌鼠动情期反应明显降低,70%表现无性别感受性.加压素受体成年雄性Wistar大鼠末端帽状硫代210.5mg/ml,0.5ml/h输注.在焦虑相关性行为中,血管紧张素结合呈序列特异性降低.血管紧张素原8周龄先天性自发性高血压雄性大鼠天然162.5ml含药脂质体溶液经门静脉或直接注射肝脏.血压呈序列特异性降低.BCR/ABL人Ph白血病细胞异植Scid小鼠硫代261mg/日,i.v.,连续9日.BCR/ABLmRNA水平降低,小鼠存活期延长.HBxHBx转基因小鼠模型硫代271mg/只/日,i.p.,连续7日.HBx基因转录物水平明显降低.0.2-1mg/只,i.p.,3次/周,8周.HBx蛋白明显减少,且可阻止肝癌前损伤.PKA人结肠癌细胞异植裸鼠硫代2150mg/kg,单次s.c..肿瘤生长呈剂量依赖性抑制.DHBV鸭乙肝病毒感染的北京鸭硫代18感染后第三天给药,20mg/kg/日,9日.病毒呈剂量依赖性和序列特异性抑制,肝脏病毒DNA几乎完全清除.注：i.v.静脉注射，i.p.腹腔注射，s.c.皮下注射.第五节反义技术的应用目前最有希望的是抗病毒类药物，因为已对许多致病病毒的基因及其编码蛋白有较多了解，并且病毒的主要蛋白在人体中大部分无相应蛋白种类，所以抗病毒的AON药物对人类正常基因干扰很小。一、抗病毒剂（一）人类免疫缺陷病毒（HIV）-1反义寡核苷酸抗病毒活性采用以下4种机制：(1)与脂质体囊化的硫代磷酸寡核苷酸不同，ODN还可独立地干扰病毒介导的细胞融合；(2)α和β构型硫代磷酸寡核苷酸通过非特异性方式干扰逆转录；(3)α和β构型磷酸二酯寡核苷酸通过序列特异性及RNAase-H非依赖性方式干扰病毒逆转录；(4)β硫代磷酸寡苷酸通过序列特异性及RNAase依赖性方式干扰病毒mRNA。反义核苷酸提供了一种选择性阻断HIV基因表达的方法。与其他逆转录酶一样，HIV也合成其主要结构蛋白，并以一种多肽前体（gag55）形式存在。该前体蛋白经病毒蛋白水解酶消化，形成成熟的病毒蛋白p17、p25和p15。研究显示，反义寡核苷酸是通过与靶mRNA序列特异性杂交抑制病毒和细胞基因表达。病毒RNA包装所必需的序列位于gag起始密码子附近，并形成稳定的二级结构。与HIVGagmRNA起始密码子互补的寡核苷酸可阻断GagmRNA的翻译，同时也破坏了RNA的二级结构。抗HIV基因治疗的主要目标是开发一种有效的基于反义技术的抗HIV策略，它可特异性地靶向HIV-1mRNA上一些必需和保守的区域，最好是多个区域。存在于所有HIV-1mRNA或病毒基因组本身两端的HIV-1TAR区是Tat反式激活所必需的，因此符合上述标准。正在开发用于治疗HIV-1的各种反义化合物如下：1.基因表达调节剂GEM-91（Hybridon公司，Worcester，MA）这是一种新的25聚体反义寡核苷酸，它可与HIV-1RNA的gag基因起始密码子互补。GEM-91通过阻断gagmRAN基因起始密码子互补。GEM-91通过阻断gagmRNA的翻译以及破坏病毒装配过程和二聚体形成期所必需的RNA二级结构抑制HIV复制。目前GEM-91正在进行Ⅱ期临床试验。2.多聚L-赖氨酸耦联的寡核苷酸 可促进序列特异性地抑制多种生物学模型中急性HIV感染，但目前尚未进行临床试验。3.反义寡核苷酸的脂质体化与游离于溶液中的同一寡核苷酸相比，掺入特定脂质体的寡核苷酸对慢性感染细胞中HIV-1复制的抑制作用可增强数倍。反义寡核苷酸对逆转录病毒的抑制作用可通过胞内稳定性进行测定。这些化合物均未进行临床试验。4.由脱氧鸟苷和脱氧胸苷组成的寡核苷酸这种寡核苷酸可抑制感染细胞培养测定系统中的HIV-1活性。寡核苷酸骨架上的硫基团虽可增强其抗病毒活性，但缺乏序列特异性相互作用，提示寡核苷酸药物的部分抗菌毒活性来自其非反义机制，而并非这些化合物最初所设想的机制。5.反义基因技术 这项技术涉及抑制HIV生长所需的基因功能，而不影响其他基因。潜在的临床应用包括从患者体内去除某些基因。经过改造的细胞将被重新输回患者体内，从而期望这些细胞发挥抗HIV的免疫保护作用。6.RNA钓铒 转显性调控蛋白（regulatorytransdominantprotein）Tat和Rev分别与新生病毒RNA的特定区域即TAB和RRE结合以激活HIV基因表达。RNA钓铒通过模拟上述这些RNA结构，引起HIV调控基因发挥功能所必需的病毒/细胞因子与螯合而发挥作用。垂钓RNA发生结合时与HIVRAN很相似，但它们结合后并不重建功能。通过这种方法它们可垂钓病毒增殖所必需的病毒/细胞因子。利用基于Rev结合元件的钓铒，即RNA-DNA嵌合寡核苷酸可能是一种更安全的基因治疗方法，可降低HIV感染者体内的病毒量。7.整合酶抑制剂 研究表明，AR177（Aronex制药公司）作为一种新寡核苷酸具有抑制HIV整合酶和防止细胞融合的作用。这种化合物已开始在HIV阳性患者进行I期临床试验。（二）单纯疱疹病毒（HSV）感染寡核苷酸具有抗HSV作用。Fennewald等（1995）研究发现，完全由脱氧鸟苷（GT）组成的寡核苷酸虽然并非为特异设计的反义药物，但能明显抑制急性感染测定系统中单纯疱疹病毒的生长。虽然这种作用的确切机制尚不清楚，但这些寡核苷酸具有毒性低和治疗指数高的优点。这些化合物作为抗疱疹病毒的治疗药物尚有待于进一步研究。（三）巨细胞病毒感染Gilead科学公司生产的核苷酸类似物cidofovir（Vistide）已进行了随机对照的Ⅲ期临床试验。静注给予Vistide可延缓艾滋病患者CMV视网膜炎进展的时间，初次治疗1周1次，维持治疗2周1次。另一反义化合物AR132（Aronex制药公司）也正在开发为用于治疗CMV感染的药物。（四）病毒性肝炎研究显示，乙型和丙型病毒性肝炎对反义寡核苷酸敏感。最近的研究发现，反义寡核苷酸具有抗丁型肝炎病毒（hepatitisdeltavirus,HDV）的活性。HDV是攻击性最强的一种肝炎，肝炎患者中15%为HDV。HDV还可迅速发展为肝硬化，它也可与HIV以共感染的形式存在。二、抗癌剂肿瘤的治疗是医学上的一大难题。目前认为肿瘤的成因是机体正常细胞内的原癌基因通过扩增、转位或突变转变为有活性的癌基因，或基因调控失效，如：抗癌基因失活引起某些细胞癌基因的过度表达。临床上所用的肿瘤化疗方法特异性差，效果不好。设想通过反义技术可特异性地抑制相应癌基因的过度表达而抑制肿瘤细胞的增殖。（一）抑制与肿瘤生长有关的基因通过反义ras逆转恶性表型，多种策略已用于逆转激活的ras基因的致瘤效应。由于位于H-ras下游的c-fos癌基因与信号转导有关，故反义fosRNA已用于显示人膀胱癌EJ细胞转化表型的部分逆转。研究显示，脂质体介导内转移反义K-ras构建子可抑制鼠腹膜腔中胰腺肿瘤的播散。反义ODN通过靶向细胞信号转导抑制肿瘤生长，该技术的靶子为PKC-a和c-raf。含有20个核苷酸的ODN（ISIS3521）是以丝氨酸/苏氨酸激酶PKC-a（一种在磷酸肌醇信号转导途径中作为细胞内受体的PKC的同工酶）为靶子，可抑制裸鼠中人肿瘤细胞系。该途径在癌细胞中常被激活，预期PKC-a的表达可终止或减缓肿瘤增殖。一项Ⅰ期临床试验显示，ISIS3521可使癌症转归。靶向另一种信号转导途径成分c-raf激酶mRNA可减缓小鼠体内移植肿瘤的增殖。但该法的缺点是反义药物必须长期服用治疗才有效。这些方法是成功应用将有赖于对信号转导级联反应途径中多个步骤的抑制，并很可能需要多个不同分子工具的联合应用。（二）反义ODN抑制生长因子表达Rubinstein等（1994）曾就此作了专题评述并报道，反义ODN因可抑制生长因子表达而成为治疗激素非敏感性乳腺癌和前列腺癌的首选药物。ODN直接针对编码生长因子如TGF-a的mRNA。表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor,EGF-R）在人横纹肌肉瘤细胞增殖中的作用显示，该受体可成为反义治疗的靶点。脂质体介导转移含有反义源碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF）或FGFR-1的附加型载体进入生长在裸鼠上作为皮下肿瘤的人黑色素瘤中，可导致这些肿瘤生长的抑制或转归，这可能是由于抑制了肿瘤内血管生长，继而引起肿瘤细胞坏死的结果。因此，对bFGF/FGFR-1介导的信号转导的抑制作用可能为进展期黑色素瘤的治疗提供了一种新手段，血管内生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）是Kaposi肉瘤自分泌产生的一种生长因子，其中Kaposi肉瘤是与艾滋病相关的最为常见的肿瘤。VEGF反义ODN可特异性地抑制裸鼠中Kaposi肉瘤细胞的生长。垂体细胞生长及功能发挥需要多种生长因子。这些肽的异常表达或调控对于垂体肿瘤的存在极其重要。研究发现，反义抑制甲状旁腺素相关肽（parathyroidhormone-related,PTHrP）基因的表达可阻止大鼠垂体肿瘤的发展和转移。这项技术可能为控制人类恶性垂体肿瘤的转移提供了一种新的治疗方法。（三）与抗肿瘤药合用在疗效不变的同时,减少各自的用药剂量，从而降低毒性。主张化疗（环磷酰胺）与bcr-abl反义ODN结合的证据支持了Skorski等（1997）对严重联合免疫缺陷（severecombinedimmuodeficient，SCID）小鼠Ph1白血病的实验研究。研究结果及其分子基础小结如下：①在携带CML-胚母危象细胞（blastcrisiscell）的SCID小鼠中，联合治疗可延缓白血病的进展；②50%经治疗小鼠的白血病可治愈；③经处理的白血病细胞可加速凋亡；④体外研究显示，与化疗配合可提高对反义bcr-abl的摄取。反义治疗还可恢复多药耐药性（multidrug,MDR）肿瘤细胞对药物的敏感性。Cucco和Calabretta（1996）用靶向mdr1mRNA的反义ODN处理SCID小鼠及体外处理长春花新碱抗性的人早幼粒细胞系HL-60/Vinc，结果表明，给予反义ODN后可使体外抗性细胞的敏感性提高120倍。注射HL-60/Vinc的SCID动物于84天内全部死亡，然而，60%经过长春新碱与反义ODN的小鼠300天时仍可存活。因此，反义治疗有可能逆转癌症患者的MDR。（四）肿瘤反义治疗的体内给药问题目前缺乏有效地转染靶细胞以用于基因置换或治疗肿瘤的方法。反义分子只转入肿瘤细胞是一种理想的方法。稳定的反义RNA表达系统在鉴别靶目标方面可能有着极大的优势，这将有利于体内ODN应用时的调控。目前采用的方法简述如下：1.局部给药利用植入的微型泵可将大剂量ODN局部释放到皮下肿瘤。2.全身给药静脉内给予抗肿瘤药物ODN对实验动物和病人均有效。3.脂质体反义复合物脂染素（lipofectin）可增强细胞对反义ODN的摄取，同时也可抑制肿瘤细胞生长。4.病毒载体病毒载体常用于回体（exvivo）基因治疗。由于该法比体内法更有效，故在临床试验中较常使用。病毒载体能够进入肿瘤细胞，并可使反义分子表达，同时它也可进行选择性表达。如果将反义序列置于调控序列的控制下，那么它只在某种特定的谱系或某种特定类型的肿瘤细胞中表达。病毒中含有的DNA序列所调控的某些癌症，如对甲胎蛋白或癌胚抗原应答，就可具有特异性。前体药物激活酶可行肿瘤特异体传递，这表明了该基因疗法的可行性。三、作用于神经系统（一）神经退行性变性疾病兴奋性氨基酸与肌萎缩侧索硬化症和阿尔茨海默病等神经退行性变性疾病有关。Berman等（1995）的研究表明，反义ODN能降低N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）在神经元中的兴奋性毒性，表明这类药物具有治疗NMDA介导的神经退性变性疾病的作用。另一种治疗神经退行性变性疾病的反义策略是基于p75。P75通过与神经生长因子（nervegrowthfactor，NGF）结合，切断对神经细胞NGF的供给，从而导神经细胞死亡。P75又称为“自杀分子（suicidemolecule）”。现已设计出一种反义ODN，它可与指导p75产生的RNA结合。目前该药物仍处于动物实验阶段。（二）脑血管疾病对于脑缺血后发生的一系列分子事件目前并不完全清楚。动物脑卒中模型研究显示，基因表达发生改变。脑缺血后发生的生化事件包括兴奋性氨基酸的增高。谷氨酸受体介导的磷脂酶与蛋白激酶的激活可引起立刻早期基因（immediateearlygene）如c-fos和c-jun的表达。已知Fos和Jun蛋白可形成激活蛋白1（activatorprotein1,AP-1），AP-1可调控其他几种基因的表达。但研究表明，这种活性可被反义c-fos寡核苷酸所抑制。反义寡核苷酸有可能成为治疗脑卒中的新方法。脑室内滴注靶向NMDA谷氨酸受体亚基之一的反义寡核苷酸可降低大鼠脑卒中模型中皮质梗死的大小。（三）反义技术用于调节神经递质众所周知，可与转运蛋白相互作用的可卡因和安非他明衍生物等这类化合物存在着滥用的可能性。因此，有必要设计出一些可选择性抑制单一类型神经递质的分子，以免滥用。反义敲除技术（antisenseknockoutapproach）可用于抑制多巴胺转运蛋白（dopaminetransporter，DAT）的活性。利用含有DAT的培养成的人成神经细胞瘤细胞测定一种称为pcDAT-A的新制备的载体的活性，该载体以反方向表达完整的大鼠多巴胺转运蛋白rDAT-1。同时对相应于DAT-1不同部分的3个合成的18聚体寡核苷酸也进行了测定。携带其中一个寡核苷酸（与编码第3个跨膜结构域的5’区反义）的pcDAT-A载体可阻断对3H多巴胺的摄取，同时还具有部分阻断多巴胺毒性的作用。四、心血管疾病（一）高血压肾素-血管紧张素在调节血压方面起着重要的作用。血管紧张素原是血管紧张素I和血管紧张素Ⅱ的前体。高水平血管紧张素原与高血压相关。研究表明，转染抗大鼠血管紧张素原反义ODN可短暂降低自发性高血压大鼠（spontaneouslyhypertensiverat,SHR）的血压，同时也降低血管紧张素Ⅰ和Ⅱ的水平。Wielbo等（1996）利用脂质体囊化的ODN对SHR进行了类似的实验，结果表明，该制剂可更有效地降低高血压。反义ODN是能过阻止mRNA翻译成血管紧张素原而发挥上述作用的。Gyurko等（1997）通过脑室内（intracerebroventricular,ICV）给予SHR大鼠靶向AT1血管紧张素受体mRNA的反义ODN，并将此结果与皮下注射反义ODN的大鼠进行了比较。结果发现，单独应用ICV注射的反义ODN而非皮下注射ODN可明显降低血压达7天之久。这种长效机制可能是由于反义ODN在核内持续存在，从而阻止mRNA转运到细胞质中所致。（二）血管成形术后再狭窄的预防基因治疗已用于防止再狭窄。反义ODN策略也可用于抑制血管平滑肌损伤后的增生。Morishita等（1995）利用含有E2F结合位点的钓铒寡脱氧核苷酸转染血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell,VSMC），结果表明，该技术可防止必需的细胞周期调控基因的反式激活，并抑制VSMC增殖。研究显示，该法可有效抑制大鼠动脉模型气囊损害后新内膜的形成。此外，反义转录大鼠胰岛素样生长因子1受体（insulin-likegrowthfactor1receptor）cDNA可抑制VSMC。另一项研究则证实了冠脉内给予反义ODN防治临床试验中的再狭窄的安全性，其中反义ODN以原癌基因c-myc为靶点。（三）血管移植物中动脉粥样硬化的预防Suzuki等（1997）利用HVJ脂质体释放细胞周期蛋白依赖的激酶2的寡核苷酸（oligo）进行冠状动脉灌输，结果表明该方法可减少鼠异向心脏同种异体移植物中的新内膜形成。（四）动脉血栓形成的防治有人研究了一类完全不同的基于单链寡核苷酸的凝血酶抑制剂。Li等（1994）合成了一段掺有共有序列（consensussequence）的15聚体（凝血酶反聚体），并测定了其在离体的主动脉血管形成术模型中抑制凝块结合的凝血酶活性和血小板血栓形成的效果。实验表明，血小板沉积减少34.5%。基于单链寡核苷酸的凝血酶反聚体是一类新的凝血酶抑制剂，它具有较强的抗凝和溶栓特性。五、炎症性疾病科学家正在研究反义治疗在下列炎症性疾病中的应用：①类风湿性关节炎；②牛皮癣；③溃疡性结肠炎；④Crohn病；⑤肾移植排斥；⑥哮喘。治疗的各种策略简述如下：（1）靶向细胞间粘附分子（intercellularadhesionmolecule,ICAM）1aRNA的反义ODN。这种策略的理论基础是ICAM-1参与炎症细胞的激活以及炎症细胞从血液迁移到组织中。通过反义非特异性机制（很可能是由于寡核苷酸内在特性）以及预期的序列特异性机制可抑制ICAM-1的表达。（2）为应答炎症刺激，可诱导一组与循环白细胞（内皮白细胞粘附分子）结合的蛋白质在血管内皮表层表达。合成的ODN可选择性地与编码下述3种内皮白细胞粘附分子（endothelial-leukocyteadhesionmolecule）的mRNA结合：人ICAM-1、血管壁粘附分子1（vascularwalladhesionmolecule-1，VCAM-1）和E-选择素（E-selectin）。（3）蛋白激酶C（proteinkinaseC,PKC）除了参与细胞内信号转导外，还在炎症过程和其他几种疾病中发挥作用。反义ODN可抑制PKC基因的表达。虽然溃疡性结肠炎与Crohn病存在多种相同的特征，但有证据表明这两种疾病性质并不完全相同。溃疡性结肠的发病机制非常复杂，组织损害可能与遗传因素、外源性促发物和粘膜免疫效应物间的相互作用有关。但一般认为这两种疾病均是炎症性疾病，免疫调节策略是处理这两种疾病的各种方法中的一种。一项Ⅱ期临床试验显示，静脉内给予反义ODNISIS2302对Crohn病患者有效。20例患者经过1个月的治疗，经半数患者出现缓解，平均缓解时间约为5个月。此外，皮质类固醇服用剂量也明显降低。目前该化合物正试用于其他炎症性疾病如类风湿性关节炎、牛皮癣和溃疡性结肠炎症。局部给予p65反义药物可改善小鼠实验性结肠炎。在慢性结肠炎中，转录因子p65明显被激活。这项研究表明，p65反义技术对Crohn病患者具有潜在的治疗作用。哮喘是一种以支气管反应性为特性的炎症性疾病，并可引起危及生命的气道阻塞。有证据表明，参与正常生理功能的内源性腺苷可能是引起哮喘的一个重要介质。哮喘患者支气管灌注液中腺苷浓度增高。Nyce和Metzger（1997）利用尘螨过敏反应性人哮喘免疫模型进行了一项随机交叉研究。靶向给予腺苷A1受体的气雾化反义ODN可使动物对腺苷或尘螨过敏原脱敏。上述研究结果提示，肺可能是反义ODN治疗哮喘以及肺部其他炎症性疾病的一个潜在的靶子。第六节临床研究表4-3已进入临床试验的ASODNs药物作用靶治疗疾病临床(期)开发公司HCMV(ISIS2922)艾滋病患者视网膜炎进入市场Isis/CIBAVisionICAM-1(ISIS2302)Crohn's病

类风湿关节炎

牛皮癣

溃疡性结肠炎

肾移植排斥II

II

II

II

IIIsis/BoehringerIngelheimPKC-a(ISIS3521/CGP64128A)癌症IIIsis/NovartisC-raf(ISIS5132/CGP69846A)癌症IIIsis/NovartisHIV(ISIS5320)艾滋病I/IIIsisHas-ras(ISIS2503)癌症IIsisHCMV(GEM132)全身性巨细胞病毒感染

巨细胞病毒性视网膜炎II

I/IIHybridonHCMV(ISIS13312)艾滋病患者视网膜炎IIIIsisHIV(GEM91)艾滋病II期后撤除HybridonLR-3280球囊扩张后再狭窄的预防IILynx/Schuarz/TanabeBCL-2(G3139)非何杰金氏淋巴瘤

急性髓性淋巴细胞性白血病

慢性髓性淋巴细胞性白血病

骨髓净化I/II

I/II

I/II

I/IIGenta

Lynx

Lynx

LynxHIV(AR177)艾滋病IAronexHIV(Gps0139)艾滋病IChugaic-myb(c-myb)急性髓性淋巴细胞性白血病

慢性髓性淋巴细胞性白血病I/II

I

c-myc(c-myc)再狭窄I

HIV(GEM92)艾滋病IHybridonPKA(GEM231)癌症IHybridonVEGF视网膜炎IHybridonHPV(ISIS2105)人乳头瘤II期后撤除Isis针对c-myb的硫代寡核苷酸在白血病治疗方面初步显示了良好的临床效果，5名白血病患者接受白消胺及环磷酰胺治疗后，再输入反义药物净化的单核细胞，其血液指标呈现持续缓解。在18名顽固性白血病患者中，c-myb寡核苷酸0.3mg/kg/日或2mg/kg/日，连续7日，静脉输注，未见剂量相关性毒性作用，1例患者存活了14个月。另1例进展期慢性白血病患者，采用自身骨髓体外反义药物处理后再回输疗法，在治疗9个月后血液学指标完全恢复正常。

互补于bcl-2的硫代寡核苷酸(G3139)已进入II期临床试验，在9例顽固性非何杰金氏淋巴瘤治疗中，每日皮下注射1次，连续2周，仅见注射部位局部炎症，未见其它药物相关性毒性作用，2例患者CT提示肿瘤明显缩小，2例患者血液中瘤细胞数减少，4例患者血清LDH降低，其中2例症状改善，采用流式细胞技术对5例患者bcl-2蛋白水平检测提示其中2例明显降低。

ISIS2302是互补于ICAM-1的硫代寡核苷酸，在20例类固醇治疗的活动性Crohn's病患者的双盲对照试验中，以0.5、1、2mg/kg剂量静脉输注26天，观察到治疗组47％(7/15)的患者病情缓解，对照组20%(1/5)的患者病情缓解，半年后随访，7例病情缓解者中有5例病情持续稳定，1例考的松用量降低。在ISIS2302治疗期间，外周血淋巴细胞明显增加，肠粘膜ICAM-1表达水平下降。另有2例并发瘘管形成的患者，经ISIS2302治疗后，瘘管痊愈，消化道梗阻症状缓解，随访1年未见复发。该结果提示在类固醇依赖性Crohn's病治疗中，ISIS2302能使病情缓解，并可使患者摆脱对类固醇的依赖性。

ISIS3521/CGP64128A在I期临床试验中，治疗4例卵巢癌患者，1例呈现部分反应，2例卵巢癌标志物CA-125降低，目前，ISIS3521/CGP64128A进入II期试验，治疗各种实体瘤包括卵巢癌、前列腺癌、脑瘤及结肠癌等，将在北美及欧州注册200例，预计1年完成。

GEM132是第一个进入临床试验的第二代反义药物，其两端各有一个修饰RNA保护帽，从而加强了代谢稳定性，在组织培养中，GEM132抗病毒活性是ganciclovir的1000倍，对ganciclovir抗性巨细胞病毒分离株对GEM132仍敏感。GEM132单剂量安全性检测显示耐受性较好，目前已进入I/II期临床试验，用于治疗全身性巨细胞病毒感染及巨细胞病毒视网膜炎。

VitraveneTM(ISIS2922，formivirsensodiuminjectable)是1998年8月26日经美国FDA批准第一个进入市场的反义药物，主要用于局部治疗对其他治疗措施不能耐受或有禁忌以及对巨细胞病毒性视网膜炎治疗方案没有明显效果的艾滋病人巨细胞病毒性视网膜炎。主要副作用为眼球发炎或虹膜炎或玻璃体炎,发生率约为25％,延缓治疗以及用通常的肾上腺皮质激素治疗可使炎症解除。第七节反义技术的价值反义药物作为一种具有高度选择性和低毒性的基因治疗药物，已愈来愈受到药商和医药研究人员的青睐，是潜在的药物和探索的工具。反义药物与传统药物相比作为治疗剂具有以下优点:1.特异性较强一个15聚体的反义寡核苷酸含有30-45个氢键，而低分子的传统药物与靶点一般只形成1-4个键。2.信息量较大遗传信息从DNA-RNA-蛋白质，用互补寡核苷酸阻断某种蛋白的合成是很准确的。反义药物以核酸为靶点,根据核酸杂交原理，反义药物能与特定基因杂交，干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递。蛋白质在人体代谢中扮演非常重要的角色，几乎所有的人类疾病都是由蛋白质的异常引起的，无论是宿主疾病(肿瘤等)还是感染疾病(肝炎等)。传统药物主要是直接作用于致病蛋白本身，反义药物则作用于产生蛋白的基因，因此可广泛应用于多种疾病的治疗，如传染病、炎症、心血管疾病及肿瘤等。与传统药物比较反义药物更具选择性及效率，因此也更高效低毒。更易合理设计新型药物。第八节反义药物的给药途径表4-4寡核苷酸的各种给药方法给药方法静脉内口服皮下皮下肿瘤的离子电渗疗法（iontophoreticdelivery）眼睛局部应用血管成形术中动脉导管给药（transcatheterdelivery）经特殊技术行胞内导向ODN靶向携带识别信号的大分子载体修饰ODN与信号肽的胞内进入途径利用肽提高膜通透性，并促进ODN的通过ODN与亲脂基团耦联或囊化进入膜载体利用链球菌溶血素0进行生化显微注射以改变细胞质膜通透性配体-受体技术：ODN靶向嗜中性白细胞脂质体介导的ODN给药聚乙烯亚胺介导的ODN给药脑细胞给药转铁蛋白受体抗体ODN结合物穿过血脑屏障（BBB）进行全身给药脑室内给药鞘内给药利用可生物降解的高分子基质进行局部给药利用可植入的给药装置回体技术（exvivoapproach）虽然在大多数研究中，ODN的给药方法通常是静脉内注射，但人们也开发出其他一些给药方法，简述如下：一、口服由于ODN在胃肠道的稳定性差且不易吸收，故一般认为ODN不适合用于口服。然而，含有RNA和DNA片段的第二代ODN可以口服给药，并可通过胃肠道完全吸收。这种化合物靶向HIV-1的gag基因，是目前正在开发用于治疗艾滋病的药物之一。二、离子电渗给药通过离子电渗疗法，ODN可经小鼠乳腺肿瘤区的皮肤给药。研究发现，ODN进入肿瘤、越过肿瘤并到达小鼠所有的器官。从肿瘤中提取的ODN经电泳分析显示，这些化合物在整个过程中均输送到各种组织中。三、眼睛局部给药紫外线暴露的大鼠眼睛经c-fosODN点滴处理后可抑制角膜中c-foc表达的增高（分子机制为光损害和细胞死亡），提示这种给药方法具有治疗作用。四、特殊技术行胞内导向某些特定的大分子可被识别，并通过受体介导的内吞作用而内化，当反义ODN吸附于这些大分子，可产生特定的靶向作用并增加细胞内摄入。目前已开发的相关技术如下：（1）ODN的3’端和5’端均被替换以防止被核酸外切酶降解，并使之可与某个载体或肽连接。（2）复合糖（glycoconjugate）可用作载体。这些大分子通过提高药物的局部浓度及药物在胞内的浓度以增强药效。（3）反义ODN与肽相连接，其目的在于协助ODN到达内质网，以便穿过内吞膜或囊状腺，并进入胞质溶胶。（4）采用具有增加细胞通透性的肽来提高ODN在胞质溶胶或核内的浓度。（5）ODN与亲脂基团耦联或囊化进入膜载体。（6）限制反义药物有效释放的主要因素是ODN不易从内体中排出，可通过内体破裂剂增强细胞质给药效果。五、生化显微注射通过显微注射直接导入细胞质的寡核苷酸快速集在细胞核中。寡核苷酸不能有效地到达指定作用部位是限制其在基因研究中的常规应用以及药物开发的主要问题。六、配体-受体技术ODN可与各种疏水基团如胆固醇或脂质共价连接以提高细胞摄入水平。七、脂质体介导的ODN给药脂质体能帮助ODN克服细胞不能有效摄入及其快速从体内丢失的困难。几种类型的ODN能有效地而稳定地掺入脂质体以便持续释放及定向给药。经内吞作用内化的阳离子脂质翻转（flip-flop）。阴离子脂质体扩散到复合物中，并与阳离子脂质形成离子对，从而引起阳离子脂质中ODN的移位，并释放到细胞的质中。脂质体介导ODN给药的优点简述如下：（1）有利于ODN给药，可用于治疗细胞内感染如HIV-1。由于病毒芽殖而修饰的细胞膜可促发对含ODN脂质体的摄入。一方面，脂质体在细胞内可防止寡核苷酸被降解，另一方面，脂质体在细胞内的降解可使ODN到达其靶RNA并发挥反义效应。（2）循环时间长的脂质体可能有利于ODN在肿瘤组织富集。这是通过某种肿瘤的可通透性血管结构产生的被动靶向作用产生。（3）抗体靶向的脂质体可增加ODN的靶特异性。八、聚乙烯亚胺介导的ODN给药聚乙烯亚胺（polyethylenimine,PEI）是一种可在体内和体外高效输送寡核苷酸和质粒的载体。PEI高效性是由于其具有一种广泛的溶酶体缓冲作用（lysosomebuffering），它即可防止DNA被核酸酶降解，又可PEI/DNA颗粒在溶酶体膨胀和破裂后得以逃逸。九、脑细胞给药脑组织给药需要一些特殊策略，ODN也同样如此，这一点非常重要，尤其是当ODN用于治疗恶性脑肿瘤和中枢神经系统（CNS）疾病时。全身性给予的ODN必须穿过血脑屏障（BBB）。BBB的特征如毛细血管内皮细胞间紧密连接（tightjunction）以及渐狭的液相内吞作用阻碍了细胞通过液相内吞作用对核酸的自然吸收。脂质体是克服这个困难的策略之一。ODN也可通过可生物降解的高分子基质在局部给药。高分子装置除了可以持续释放ODN外，还可防止ODN在那种生物条件下被降解。这类可植入系统在治疗脑肿瘤时可通过BBB。将ODN导入脑组织并穿过BBB的另一技术是采用直接注入脑脊液的途径。十、回体技术回体基因疗法中，应用反义化合物的可能性很高。在将存活细胞输回患者体内之前，可先去除异常细胞，并将反义化合物导入干细胞中用于治疗血液系统肿瘤。这种技术可避免因全身给药而产生的毒副作用。第九节反义寡核苷酸的药代动力学[2,3,7-11]迄今为止，PS-ODN的药代动力学研究都依赖于放射性同位素标记示踪分析。PS-ODN口服给药后能被吸收，但生物利用度很低。PS-ODN经iv、ip或sc给药后，与血浆蛋白有很高的结合率，药物分布于除大脑以外的所有组织。由于体内广泛存在的核酸酶，天然寡核苷酸极易被降解，故实验中多采用修饰的寡核苷酸，以增强其核酸酶抗性。寡核苷酸的修饰方法有多种，如硫代、磷酸三酯、甲基磷酸化、a-寡核苷酸、二硫代磷酸酯、2'-修饰、2'-5'连接及肽核酸等，其中研究最深入、应用最广泛的是硫代寡核苷酸，其具有良好的水溶性、稳定性及易于大量合成，基本上能满足临床治疗的需要。对寡核苷酸药代动力学的了解也基于对硫代寡核苷酸的药代动力学的认识。研究表明，采用多种给药途经包括皮下、皮内、静脉及腹腔注射，除脑组织外，硫代寡核苷酸可分布全身各组织器官，主要分布于肝、肾、脾及骨髓，肝脏累积药物的速度最快，1-2小时内累积量达用药量的20％，同时其对药物的清除也是最快的，肝脏清除半衰期为62小时，而肾髓质则为156小时。细胞内的分布也较广泛，但不同类型细胞之间亚细胞分布具有明显差异。硫代寡核苷酸血浆分布半衰期(t1/2a)<1小时，清除半衰期(t1/2b)约40-60小时，在血浆中，与血浆白蛋白及a2－巨球蛋白相结合，但其亲和力较低，与其它药物分子如青霉素及阿斯匹林等的亲和力相当，这可能为硫代寡核苷酸提供了一个贮藏所，防止肾脏的快速排泄。各种组织抽提寡核苷酸分析显示硫代寡核苷酸主要从3'端降解，也可见5'端或3'与5'端降解，另有实验结果显示核酸内切酶在其代谢过程中也起一定的作用。硫代寡核苷酸主要排泄途径是经尿排泄。

一、啮齿类药代动力学25mer35S标记硫代寡核苷酸单次静脉给予小鼠和大鼠，30分钟内即可观察到广泛的组织分布，肾及肝组织中浓度最高，脑中浓度最低，t1/2a为0.95h，t1/2b为48h，血浆中寡核苷酸PAGE可见全长及降解片段，寡核苷酸主要以降解产物形式经尿排泄，48h内尿内排泄40％。皮下、腹腔内及真皮内注射获得的血浆峰值浓度较静脉注射的低，但血浆清除及组织分布模式相似。14C标记硫代寡核苷酸玻璃体内注射显示玻璃体及视网膜的半衰期分别约为60h和90h。

二、猴体内药代动力学硫代寡核苷酸在猴体内的吸收、分布及排泄与啮齿类相似，静脉注射后，血浆t1/2a为0.6-1h，t1/2b为42-56h，血浆峰值浓度和尿中排泄百分率呈剂量依赖性，静脉内注射1mg/kg和5mg/kg，96h后尿中排泄分别约为27％和53％。

三、人体内药代动力学针对p53mRNA的20mer硫代寡核苷酸以0.05-0.25mg/kg/h连续10日静脉输注17名白血病患者，血浆浓度范围在2.1-6.4mg/L(0.32-0.97mm)，24h内达稳定状态，同时尿中排泄60％。在HIV-1感染患者，以0.1mg/kg单次剂量输注35S标记硫代寡核苷酸(互补于gag基因)，2h后，血浆峰值浓度达295.8ng/ml，t1/2a为0.18h，t1/2b为26.7h。PAGE分析显示全长寡核苷酸在血浆中持续达2h，96h内尿中排泄70％，大部分为降解产物。最近，在5名白血病患者，以0.05mg/kg/h连续10日缓慢静脉输注硫代寡核苷酸，t1/2b为5.9-14.7日，尿中放射性回收率占总剂量30-60％，其中30％为完整药物。采用毛细管凝胶电泳对完整药物水平进行详细分析显示20mer硫代寡核苷酸以0.06-20mg/kg剂量输注2h后检测，血浆峰值浓度随剂量呈线性增加，剂量为2mg/kg时，完整药物的血浆峰值浓度为9.5mg/ml。然而，血浆中药物的清除也呈剂量依赖性，2mg/kg剂量的清除率为1.28ml/min/kg，而0.5mg/kg剂量的清除率为2.07ml/min/kg。尿中基本上未发现完整药物。

综上所述，药代动力学研究表明，硫代寡核苷酸肠道外途径给药，能被很好地吸收，并广泛分布于外周组织，不透过血脑屏障，主要通过缓慢代谢而清除，1日1次或隔日1次全身用药方案是可行的。口服给药，生物利用度很低，<5%，主要由于肠道内降解作用所致。第十节反义寡核苷酸的毒性[2,9,10,12-14]PS-ODN的毒性表现为：凝血时间延长、补体激活和继发致死性血液动力学变化、肾脏毒性、免疫刺激以及肝脏、血液生化的变化等。硫代寡核苷酸的体内毒性作用似乎是种属依赖性的。迄今，小鼠急性LD50均超过500mg/kg。在啮齿动物，多途径给予多种硫代寡核苷酸，常见的剂量限制性毒性作用是免疫刺激，表现为淋巴组织增生，脾肿大，多器官单细胞浸润，这些作用仅发生于剂量超过20mg/kg、长期给药时，且呈剂量依赖性，但所有这些作用是可逆性的。长期真皮内给药毒性作用最明显，可能是由于局部高浓度引起局部细胞因子释放和细胞因子瀑布的启动。在剂量超过100mg/kg时，可见肝酶水平轻微升高及轻度血小板减少。最近，文献报道互补于relAmRNA(NF-kB)的24mer硫代寡核苷酸腹腔注射给CD-1小鼠，每周3次，连续2周，100及150mg/kg剂量导致明显毒性作用，甚至动物死亡，死因可能是急性肾衰，其它可见血清AST及ALT增高及严重血小板减少，这些改变显示受损的组织器官与硫代寡核苷酸的主要组织分布相一致，可能与其在这些组织中长时间的累积及其代谢物有关。此外，一些实验显示某些毒性作用与寡核苷酸序列有关，如针对NF-kBp65起始密码区的正义序列引起小鼠脾增大，而相同碱基构成的反义序列则无此作用。

在猴实验中，最明显的剂量限制性副作用是血压降低伴心博徐缓，外周血白细胞总数及中性白细胞瞬时下降，这可能与通过旁路C5补体激活有关。所检测的硫代寡核苷酸似乎均可诱发该作用，但不同序列或长度的寡核苷酸在作用强度方面可能存在轻微的差异。另一种明显的毒性作用是部分活化凝血酶原激酶时间(aPTT)延长，在