第四章细胞工程制药

第四章细胞工程制药

细胞工程药物第一节、动物细胞工程制药基本技术及实例

第二节、植物细胞工程制药基本技术及实例

作业分别列出1种动物细胞、植物细胞工程制药的实例细胞工程指以细胞为研究对象，通过细胞培养获得自然界难以获得的珍贵产品的新兴生物技术。微生物、动物、植物细胞培养特性细胞种类微生物细胞植物细胞动物细胞细胞大小（um）1~1020~30010~100倍增时间（h）0.3~5大于12大于15营养要求简单复杂复杂对剪切力不敏感敏感敏感光照要求不要求要求不要求主要产物氨基酸、抗生素、核苷酸、有机酸色素、次生代谢产物疫苗、抗体、多肽动物细胞工程药物适合真核表达的的药物蛋白或亚单位疫苗单克隆抗体药物筛选模型植物细胞工程药物次生代谢产物药用成分萜类单萜龙脑倍半萜青蒿素二萜紫杉醇三萜人参皂苷四萜番茄红素多萜杜仲胶甾体类薯蓣皂苷酚类简单丙烷类丹参素香豆素类甘草香豆素木脂素类厚朴酚苯醌类连翘苷萘醌类胡桃醌蒽醌类金丝桃素菲醌类丹参醌黄酮类甘草黄酮鞣质（单宁）木麻黄宁含氮化合物生物碱喜树碱第一节、动物细胞工程制药基本技术一、动物细胞培养技术：概述、仪器设备、培养基、培养方法、种质保存、大规模培养技术二、动物细胞融合技术及单克隆抗体制备（略）三、转基因动物技术（略）四、核移植及动物克隆技术（略）五、干细胞技术（略）动物细胞方法（一）组织块培养法（二）细胞单层培养法（三）单细胞微量板克隆技术动物细胞培养概述动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。培养细胞的特性悬浮型—血液、淋巴细胞、杂交瘤细胞贴壁型：[A]上皮细胞型[B]成纤维细胞型[C]游走细胞型[D]多形细胞形（1）动物细胞贴壁生长特性（2）动物细胞接触抑制特性兼性贴壁型：动物培养细胞的优点（1）细胞经培养后形成的细胞系和细胞株，特征均一。（2）理化环境可控制，培养物可直接被观测。（3）提供大量均一的细胞供制备用。（4）便于进行人工筛选。（5）结合显微电影技术，可观察细胞代谢活动和反应。

应用：（1）生产有重要价值的蛋白质产品分泌性的蛋白质产品（2）培养皮肤细胞用于移植形成组织（3）检测有毒物质致癌致畸引起染色体数目和结构改变

（4）理论研究培养正常或异常细胞用于生理、病理、药理研究（1）动物细胞贴壁生长特性（2）动物细胞接触抑制特性细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。动物细胞培养所需仪器设备实验室要求（A）和缓冲间相连，缓冲间内备消毒服装和鞋，口罩等，入内换上。（B）室内空气不流通，有适当的光线，清洁，干燥.万级。（C）侧部可设传递窗，用于物品传递。（D）有消毒用紫外线灯（1）培养器具（2）超净工作台（3）CO2培养箱（4）倒置显微镜（5）纯化水装置（1）培养器具培养瓶培养板培养皿（2）超净工作台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。100级超净工作台指标：（≥0.5цm≤3.5粒/L）（3）CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。二氧化碳的作用：细胞生长需要、维持pH值。（4）倒置显微镜（5）纯化水装置动物细胞的培养基动物细胞的培养基组成----氨基酸、葡萄糖、蛋白质、核酸类物质、维生素、辅酶、激素、生长因子、微量元素、缓冲系统。1、培养细胞的培养液要求2、天然培养基3、合成培养基4、无血清培养基1、培养细胞的生存环境适宜的温度----人和哺乳动物培养细胞最适温度均为35－37℃。气体环境和氢离子浓度----需要一定量的O2和CO2（95％空气+5%CO2）；pH7.2-7.4营养物质----适当的培养基环境无毒和无菌：双抗、消毒渗透压：培养液要求氨基酸---氮源盐类---钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，氯离子，硫酸根离子，磷酸根离子，碳酸氢根离子等葡萄糖：供能缓冲系统---CO2缓冲系统或HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）生长因子---PDGF，EGF，FGF等其它成分---维生素，矿物，有机补充物，激素等平衡盐溶液（BSS）

功效：①维持渗透压②提供缓冲系统③提供水分和无机盐4、天然培养基天然培养基如----血清，血浆，组织浸出液等优点----营养成分丰富，培养效果好缺点----来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染天然培养基的类型：[A]乳蛋白水解物培养基[B]酪蛋白水解物培养基[C]血清及胚胎浸出液培养基5、合成培养基合成培养基--是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。优点--标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。缺点--缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。目前常用合成培养基＋血清来培养细胞合成培养基的类型：（A）Eagle培养基（内含13种氨基酸、9种维生素、多种无机盐）（B）Ham氏F10培养基（内含20种氨基酸、多种维生素、10种无机盐）（C）199培养基（D）Waymouth氏MB752/1培养基（E）NCTC109培养基6、无血清培养基无血清培养基----在合成培养基中加入起血清作用的种类激素和生长因子，如铁转运蛋白、乙醇胺、胰岛素、硒、氢化可的松、维生素C、促胃激素等等。血清的成分：①激素：胰岛素、胰高血糖素、生长激素、孕酮、氢化可的松、雌二醇等②生长因子：表皮生长因子、神经生长因子、成纤维生长因子、血小板生长因子③结合蛋白：白蛋白、转铁蛋白等④贴壁和铺展因子物质：如纤维粘连素、多聚赖氨酸、胶原、血清铺展因子等。⑤多种金属离子⑥低分子量营养因子：维生素A、维生素C、脂肪酸等⑦不明成分动物组织块培养法将动物组织切成直径为1—2mm的小块、并且进行培养的方法称为动物组织块培养法。有些动物组织如人的皮肤细胞，由于分散成细胞十分困难，因此常常采用组织块培养法。动物组织块固着之后，加培养液，于37℃、CO2培养箱中、通入含5%CO2的空气进行培养，即可在组织块周围长出新的细胞单层。动物组织培养过程中，进行旋转或者振荡，培养效果更好。动物细胞单层培养法动物组织块经过胰蛋白酶消化分散成单细胞或者细胞团块之后，粘附于培养基中，培养成新生细胞单层的方法称为动物细胞单层培养法。动物细胞单层培养法包括二个过程：1、组织块分散成单细胞2、培养1、组织块分散成单细胞消化分散组织块的方法分为三种：（1）酶消化法（2）物理分散法（3）酶消化与物理分散结合法

2、培养上述细胞悬液经过计数、稀释之后，接种于无菌培养器中，加入培养液于37℃条件下培养，细胞即粘于瓶底或者转瓶内壁，并且开始生长形成单层。接种浓度：

上皮细胞1*105—3*105个/毫升。

成纤维细胞2*105—6*105个/毫升。

成体细胞应高于胚胎细胞。培养时间：

上皮细胞5—7天形成单层。成纤维细胞3—4天形成单层。培养条件：

动物细胞的需氧量较低，一般通入含5%CO2的空气进行供氧，有利于维持培养基的PH值。培养方法（1）原代培养（2）传代培养（1）原代培养定义：从新鲜供体取得组织细胞后在体外进行首次培养，一般持续1－4周。原代细胞：直接将动物组织和器官经过粉碎、消化而制得的悬浮细胞步骤：取材---组织分离—原代细胞---培养（2）传代培养定义：当原代培养的细胞相互汇合时，细胞由原培养瓶消化、收集、稀释后传到新的培养瓶的过程。注意：原代细胞类型不一，利用不同的消化时间和消化液。细胞系---原代培养物首次传代成功后即成细胞系。[A]有限细胞系：传代细胞系[B]连续细胞系：转化细胞系传代细胞系：又称二倍体细胞系，原代细胞经过传代、筛选、克隆等步骤，从多种细胞中纯化得到的某种具有一定特征的细胞系。步骤：[A]贴壁细胞：去除培养基---胰蛋白酶消化---加入培养液，形成细胞悬液---稀释传代细胞系---培养[B]悬浮细胞：收集细胞悬液---离心搜集细胞---用培养液稀释---稀释传代细胞系---培养传代细胞：（1）具有二倍性染色体（2n），染色体核型正常。（2）具有明显的贴壁依赖、接触一致性（3）培养条件下一般可联系传代50代，不能进行无限期的分裂繁殖。（4）无致癌性。目前已获得了多种人胚胎肺二倍体细胞，来源于3-4个月的胚胎肺组织，如：W1-38；MRC-5；MRC-9；IMR-90；2BS；KBM-13；LS-7

转化细胞系：正常细胞经过某个转化过程，失去正常细胞的特点而获得无限增殖能力的细胞系。特征：原代细胞相比，其形态、染色体结构、倍增时间、营养要求、生理生化特性、病毒敏感性、抗原性、上均发生了变化，并且具有致癌性。来源：自然转化；人为转化；肿瘤组织目前已经获得的确立细胞系有：[A]BHK-21细胞地鼠幼鼠肾脏[B]Hela细胞人子宫癌细胞[C]Vero细胞非洲绿猴肾脏细胞[D]CHO细胞中国仓鼠卵巢细胞[E]Namalwa细胞肯尼亚淋巴瘤病人转化细胞系单细胞分离培养单细胞分离培养也称为细胞克隆培养，是指将单个细胞培养成纯细胞系群的技术。由于动物细胞具有集群效应，单个细胞在培养基中难以生长。因此在克隆株培养过程中，常常采用：（1）使用条件培养基进行培养。（2）在培养基中加入饲养细胞----如加入小鼠胸腺细胞和小鼠腹腔巨噬细胞。单细胞微量板克隆技术1、微量板克隆技术2、单细胞微量板克隆技术的特点和应用1、微量板克隆技术微量板是指孔径为6mm，容量为0.3ml的多孔培养板。常用的有96孔、55孔、24孔。细胞克隆时，将细胞稀释成10个/毫升以下的悬浮液，然后向每1微孔中加入0.1毫升，则每1孔中的细胞数平均为1个。接种后在含5%CO2的空气的培养箱中进行培养，每隔4—8天更换一次新的培养液0.2ml，直到形成单克隆细胞株。继代培养时，吸除培养液，用不含Ca、Mg的平衡盐溶液冲洗，再用胰蛋白酶进行消化，然后用培养液洗涤，再转移到25cm2表面的培养瓶中，加3ml培养液进行培养，几天后就会长成成片的新克隆细胞。2、单细胞微量板克隆技术的特点和应用微量板细胞克隆过程中，由于每一个克隆肯定来源于同一个细胞，其培养的重复性和可靠性均十分良好。微量板细胞克隆技术可用于建立纯细胞株、检查细胞遗传性的一致性，还可用于分离细胞变种。微量板细胞克隆技术在评价药物、毒物对细胞生长的影响、筛选淋巴细胞杂交瘤工程、基因和细胞工程、制备单克隆抗体工程中具有重要作用。动物细胞的种质保存技术1、种质保存的必要性（1）动物细胞在连续的继代培养中，容易污染和产生多种细胞混杂。（2）细胞株在继代培养过程中常常发生变异。（3）二倍体细胞存在寿命限制，无法进行大多的传代培养。2、保存形式（1）组织块（2）细胞悬浮物（3）细胞单层培养物3、保存方法4、超低温泠冻技术3、保存方法（1）常温法----将特定的动物细胞于20--30℃下进行保存的方法。

如人羊膜细胞单层于28℃下可保存1个月。

人肾细胞单层于25--30℃下可保存1个月以上。

人二倍体细胞单层可保存二周，中间换液则可保存30天以上，（2）低温法----将特定的动物细胞于4℃下进行保存的方法。

如人胚组织块于4℃下可保存14—30天。（3）超低温泠冻法----将特定的动物细胞于-70℃以下、或者在液氮中进行保存的方法。超低温泠冻法可以长期保存动物细胞，如二倍体细胞2BS自1973年来保存至今，其遗传性仍然没有变化。4、超低温泠冻技术（1）防冻剂准备（2）超低温泠冻的具体方法（3）超低温泠冻后的解冻方法

（1）防冻剂准备超低温泠冻法需要使用防冻剂，以减少细胞在冻结过程中所受到的损伤。常用的防冻保护剂有：甘油、DMSO。[A]、甘油----毒性较小，能够结合水，减少组织结冰量，防止细胞内盐浓度升高，具有保护细胞的作用。其使用浓度一般为5—20%。[B]、DMSO----是目前应用较多的一种保护剂，使用浓度为5-12.5%，与甘油相比，DMSO的毒性更低、抗冻能力更强。（2）超低温泠冻的具体方法先配制8-10%的DMSO+15-20%的小牛血清+适量NaHCO3的保护液

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将细胞培养物消化、分散、离心，收集单细胞

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按5*106个/ml的浓度添加保护液，1ml/支分装于安瓿瓶中

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0-4℃放置2-4小时

↓-20℃放置2-4小时↓

-70℃2-4小时↓在液氮中进行保存（3）超低温泠冻后的解冻方法将安瓿瓶取出，包裹4层纱布浸入40℃水中，振摇融化40秒

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混匀后立即接种到1-2瓶100ml的培养瓶中

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按1-2-4-8ml的方式依次加入生长液。最终加至20ml。注意事项[A]、保护液中含DMSO时，可直接用来接种。[B]、保护液含甘油时，应该离心除去甘油以防影响细胞增殖。动物细胞融合技术动物细胞融合技术----也称动物体细胞杂交技术，是指二个或者二个以上的动物细胞在外力作用下，合并为一个多核细胞的过程。细胞膜蛋白质重新分布是细胞融合的基础。（一）促融因素（二）细胞之间的融合（三）融合后杂种细胞的筛选技术动物细胞融合（一）促融因素1、病毒诱导融合2、PEG诱导融合3、电场诱导融合4、其它诱导融合（1）聚乙烯醇（2）离心力1、病毒诱导融合某些不同种属的动物细胞在特定病毒、病毒外壳或者病毒碎片的作用下，可以发生融合作用。如仙台病毒、流感病毒、新城疫鸡瘟病毒、疱疹病毒等。当二种不同的动物细胞混合物中存在大量病毒时，病毒或其组分会在细胞间起粘连作用而使细胞聚集成团，细胞膜上的蛋白质和脂质双分子层产生重排、进而结合成一个整体。病毒所诱导的融合是随机的，无法人为控制，同时融合率较低。2、PEG诱导融合当二种不同的动物细胞混合物中存在PEG时，就会产生细胞聚集作用。在除去PEG的过程中，即产生细胞融合现象。所用的PEG分子量在1000-6000之间，一般浓度为40-50%，在37℃下作用2-3分钟，其促融效果最佳。PEG促融合的作用机理不清，其促融作用也具有随机性，无法人为控制。聚乙二醇(PEG)法二种原生质体等量混合之后，加入聚乙二醇（PEG）进行融合。所使用的PEG分子量要求为1000-12000。再加入Ca、Mg。最终浓度要求：

PEG----30-40%

MgCl2----20mmol

CaCl2----50mmol

PH=9.0为了提高融合频度，同时可采用电诱导融合法、紫外线照射融合法。

聚乙二醇法的步骤图示融合液：含山梨醇或甘露醇，Ca2＋，K＋。诱导液：融合液＋20％－45％PEG稀释液：含葡萄糖，NaOH，甘氨酸等。

3、电融合法原理：在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面电荷发生改变，从而使原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而连接闭合形成融合体。电场诱导融合将二种细胞混合物经过10-100V/cm的低强度非均匀交变电场作用时，细胞之间就会发生紧密接触，形成稳定的串珠状偶极子排列。在此基础上再对细胞实施瞬间高强度电脉冲就会发生膜击穿，不同细胞间通过膜脂质分子重排就能实现融合，形成一个双核或者多核的细胞。一般来说，击穿电压为0.5-10KV/cm，作用时间为30-50微秒。电场诱导融合不损伤细胞，具有可人为操作的控制的特性，融合率较高。

电融合仪（二）完整细胞之间的融合取一定数量（107-108个/ml）的二种亲本细胞，充分混合

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离心，取下层细胞悬液0.1ml

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逐滴加入0.4ml、37℃、40%的PEG溶液，37℃静置90秒

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缓慢加入5-10ml无血清培养液，摇晃4-5次，离心，除去上清液

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每0.1ml细胞悬液加入25ml完全培养基，以每孔0.1ml分装于96孔培养板上。

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37℃下CO2培养箱中培养。动物细胞融合动物细胞的融合还常常用到灭活的病毒作为诱导剂（三）融合后杂种细胞的筛选技术筛选杂种细胞的目的是为了获得性能优良的杂合细胞。1、杂种细胞的筛选原理2、筛选系统1、杂种细胞的筛选原理将融合后的细胞混合物于选择性培养基上培养，终止那些同型多核、异型多核细胞以及未能发生融合的亲本细胞的生长繁殖，而仅仅允许异型双核细胞繁殖。（1）同型多核融合细胞----无法合成DNA，而失去繁殖能力。（2）异型多核融合细胞----细胞核不能进行再次分裂，也失去繁殖能力。2、筛选系统（1）HAT选择系统（2）抗药性选择系统（3）营养互补选择系统（4）原位杂交法（略）（5）基因探针选择法（略）（1）HAT选择系统正常的动物细胞，其DNA的合成途径有二条：全合成途径----利用外源性营养物合成DNA。这一途径能被氨基喋呤所阻断。补救合成途径----利用游离嘌呤和嘧啶来合成。HAT是含有次黄嘌呤（H）+氨基喋呤（A）+胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基。[A]、骨髓瘤细胞----骨髓瘤细胞能够在体外长期分裂繁殖，但是其DNA合成存在着缺陷。当培养基中含有氨基喋呤（A）时，骨髓瘤细胞就无法正常生长。

HPRT-型骨髓瘤细胞----属于次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶缺陷型细胞，其嘌呤只能通过全合成途径进行合成。

TK-型骨髓瘤细胞---属于胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型细胞，其嘧啶只能通过全合成途径进行合成。[B]、淋巴细胞----同时含有合成DNA的二条途径，但是不能够在体外长期分裂繁殖。在人工培养基中的存活时间只有1-2天。[C]、骨髓瘤细胞+淋巴细胞=杂交瘤细胞----既能够在体外长期分裂繁殖，又能够通过二条途径合成DNA因此在带有选择性的HAT培养基中，只有杂交瘤细胞才能正常存活。（2）抗药性选择系统利用生物细胞对于药物敏感性的差异程度，来筛选杂种细胞的方法，称为抗药性选择系统。一种亲本细胞M对药物A敏感、同时对药物B不敏感。另一种亲本细胞N对药物A不敏感、而对药物B敏感。M+N融合后的杂合细胞P同时对药物A、B均不敏感。那么，在同时含有药物A、药物B的选择性培养基中

（A）亲本细胞M不能生长

（B）亲本细胞N也不能生长

（C）只有杂合细胞P才能在选择性培养基中存活。这样，经过反复分离和继代移植，就可以筛选出杂种细胞。（3）营养互补选择系统生物细胞在缺乏某种营养成份时就不能生长，这种细胞称为营养缺陷型细胞。

A亲本细胞为色氨酸缺陷型。B亲本细胞为苏氨酸缺陷型。A+B融合后的杂合细胞C则为非缺陷型。在同时不含色氨酸+苏氨酸的选择性培养基中。A、B亲本细胞均不能正常生长而只有A+B融合后的杂合细胞C才能存活动物细胞大规模生产技术动物细胞大规模培养技术是指在人工条件下，在细胞生物反应器（bioreactor）中，进行大量培养有用的动物细胞，生产药品的技术。20世纪60-70年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。是目前生物高科技药物大规模生产的核心技术（一）培养材料（二）培养基（三）培养方法（四）动物细胞生物反应器（五）操作方式（六）动物细胞培养国内外生产现状（一）动物细胞大规模培养材料传代细胞系工程细胞系：采用细胞融合或基因工程技术构建的细胞系（二）培养基1、含小牛血清的培养基----在培养基中添加5-10%的小牛血清。2、不含小牛血清的培养基----具体有三种类型

（1）基本合成培养基

（2）基本合成培养基+生长因子

（3）基本合成培养基+组织抽提物起血清作用的各类生长因子----铁传递蛋白、乙醇胺、胰岛素、促胃酸激素、维生素C、可的松、硒等等成份。（二）培养方法1、细胞悬浮培养法：CHO细胞(中华仓鼠卵巢)、BHK-21细胞(仓鼠肾)，杂交瘤细胞，昆虫细胞等进行悬浮培养2、滚瓶培养法3、微载体培养法：(贴壁-悬浮培养)4、固定化培养法：人二倍体细胞、传代细胞Vero细胞(非洲绿猴肾)等利用载体进行贴壁培养1、细胞悬浮培养法（1）细胞悬浮培养法的概念（2）细胞悬浮培养法的工艺流程（3）细胞悬浮培养法的注意事项（1）细胞悬浮培养法的概念是细胞在培养液中呈现悬浮生长繁殖的方法称为细胞悬浮培养法，是细菌发酵基础上改进的主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等,也适用于兼性贴壁细胞气升式，搅拌式反应器细胞悬浮培养法的操作方式有3种：分批法、半连续法、连续法。细胞悬浮培养法适用于培养确立细胞株、杂交瘤细胞、肿瘤细胞、血液细胞和淋巴细胞。可用来大量生产疫苗、a-干扰素、白介素、淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体（McAb）。（2）细胞悬浮培养法的工艺流程由配料罐→培养液贮罐→平衡罐→前培养罐→主培养罐→培养液分离槽→离心→提取→干燥设备所组成。在配料罐内配制培养液，经过无菌过滤之后，送入培养液贮罐

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送入平衡罐，调整氧化还原电位至70-100Mv，以提高细胞生长繁殖速度

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送入前培养罐进行细胞增殖培养，再送入主培养罐生产和合成药物

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培养后的细胞悬液送入收集罐和分离槽→离心→提取→干燥设备（3）细胞悬浮培养法的注意事项A、在培养过程中，为了保证细胞处于单颗粒均匀悬浮状态，需要采用搅拌式反应器或者气升式反应器，以较低的搅拌速度，并以一定速度通入含水量5%CO2的无菌空气，来保证细胞处于悬浮状态，并维持培养液中一定的溶解氧。B、为了使细胞不至于产生凝聚、成团或者沉淀，在培养基的基础盐溶液中不加Ca和Mg。同时间歇式或者连续地更换部份培养液。C、在进行动物细胞培养过程中，随时检测和控制培养过程的温度、压力、溶解氧、CO2、PH值、氧化还原电位、搅拌速度、通气量、营养成份。D、细胞密度：在动物组织中的细胞密度为109个/ml，为自然界中的最高密度状态。体外悬浮细胞培养状态，细胞密度一般控制在5*106个/ml。在新颖的灌流培养系统中，细胞密度可达到107个/ml。4、固定化培养法（1）固定化培养法的定义（2）动物细胞的固定化培养方法（3）目前已经开发的固定化培养装置（4）中空纤维培养器（1）固定化培养法的定义又称大载体培养，指采用高分子材料将细胞限制或者定位于特定的空间位置，制成固定化颗粒，进而在培养液中培养的技术称为细胞固定化培养法。固定化培养有优点有：

A、细胞可维持在较小体积的培养液中生长。

B、对细胞抗剪切力和污染力强。

C、易于更换培养液。

D、细胞和培养液容易分离，分离纯化简单。

E、细胞生长密度高，培养液中产物浓度高。（2）动物细胞的固定化培养方法吸附法----所用载体有陶瓷颗粒、玻璃珠、硅胶颗粒、中空纤维膜、中空纤维培养器。包埋法----将细胞包埋于海藻酸钠、海藻酸钙、琼脂、琼脂糖、胶原、血纤维等海绵状基质之中。微囊法----将细胞好的细胞，再用长链氨基酸聚合物包被形成半通透性外被膜。（3）目前已经开发的固定化培养装置1、多层平板式反应器2、多层园盘式反应器3、螺旋转膜式反应器4、多层托盘式反应器5、卷带式反应器6、中空纤维筒式反应器（下面以此作为主要讲解内容）7、流化床式反应器8、微载体搅拌式悬浮培养反应器9、笼式通气搅拌反应器10、贴壁培养反应器11、蜂窝状反应器培养筒内由数千根中空纤维所组成，封存在特制的圆筒里。圆筒内形成2个空间：每根纤维的管内为“内室”，灌流无血清培养液供细胞生长,管与管之间的间隙为“外室”。接种的细胞贴附“外室”管壁上，并吸取从“内室”渗透出来的养分生长繁殖。培养液中的血清也输入到"外室"，由于血清和细胞分泌产物如单抗的分子质量大而无法穿透到"内室"去，只能留在"外室"并且不断被浓缩。（4）中空纤维培养器当需要收集这些产物时，只要把管与管之间的“外室”总出口打开，产物就能流出来。细胞生长繁殖过程中的代谢废物，因为都属小分子物质，可以从管壁渗进“内室”,最后从“内室”总出口排出,不会对“外室”细胞产生毒害作用。一般细胞在接种1～3周后，就可以完全充满管壁的空隙。细胞厚度最终可达10层之多。细胞停止增殖后，仍可以维持其高水平代谢和分泌功能，长达几个星期甚至几个月。中空纤维培养法模拟体内的三维培养状态，细胞接种在中空纤维的外腔，利用中空纤维模拟人工毛细血管供给营养，使细胞高密度生长材料有硅胶，聚砜，聚丙烯等，为半透膜优点细胞生长密度高，可达108个/ml以上。细胞处于接近生理状态的理化梯度之中。营养物质可以有效地分布，代谢产物能够及时排出。细胞培养可达数月，易于实现连续培养。细胞分泌的蛋白质浓度高，产品纯度可高达60-90%。反应器体积较小。可培养多种细胞，有利于降低成本。2、滚瓶培养适用于贴壁依赖型细胞和兼性贴壁细胞。放大容易，也能实现灌流培养。操作繁琐，传代或放大时需要用蛋白酶将细胞从瓶壁上消化下来。2、微载体培养法（1）定义----将细胞吸附于微载体表面，再在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面生长成单层的方法称为微载体培养法。（2）微载体培养法的优点:兼有贴壁培养和悬浮细胞培养的双重特点。在不增加培养罐体积的条件下就能增加动物细胞产量。60-250um的颗粒，创造大面积供细胞贴附生长载体体积小，比重轻，在轻度搅拌下即可携带细胞悬浮于培养基20世纪80年代正式用于工业化生产各种疫苗和细胞产品（3）微载体培养法所用的材料对细胞无毒；容易使细胞产生贴附；其密度大于1；溶胀后微粒的直径为200-300um，可容纳几百个细胞；耐高温；非刚性，避免相互碰撞对细胞损伤；不吸附培养基中营养成分；多次使用。目前已经选用的材料有：

DEAE-Sephadex-A50 DEAE-Sephadex-A52

QAE-Sephadex 经处理的塑料尼龙

二甲基氨基丙基聚丙烯酰胺聚苯乙烯市场上出售的商品微粒有：

DEAE-交联葡聚糖（Cytodex-1，Superbeads）

二甲基氨基丙基聚丙烯酰胺（Biocarrier）

聚苯乙烯（Biosilon）商业化微载体商品名基质带电基和形状直径大小比表面积密度透明性交换当量meq/g/um/(cm3.g-1)(g.ml-1)Cytodex1葡聚糖DEAE1.5球状131~21060001.03+Superbeads葡聚糖DEAE2.0球状136~2055000~6000ND+Biocarrier聚丙烯酰胺二甲胺丙基1.4球状120~18050001.04+Cytodex2葡聚糖三甲基-2-羟氨基丙基球状114~19855001.04+Cytodex3葡聚糖60ug胶原/cm2球状133~21545001.04+Ventragel交联明胶明胶球状150~250NDND+Celibeads交联明胶明胶球状115~2353300~43001.03~1.04+Biosilon聚苯乙烯负电荷球状160~3002251.05±Cytosperes聚苯乙烯负电荷球状160~3002501.04±DE-53纤维素DEAE2.0柱状40~50NDND-（4）Cytodex-1微载体培养法的技术指标干颗粒直径60-87um、在培养液中可膨胀成160-230um，每克微粒的表面积为0.6平方米，相当于7个标准转瓶（直径285mm*长度110mm）、采用培养罐进行培养。Cytodex-1的浓度为1mg/ml。相当于8000-9000粒/ml。其表面积为10cm2。细胞生长密度可达105个/ml。培养前24小时，将细胞贴附于载体上。培养液、葡萄糖、细胞同时加入培养罐中。温度为37℃PH=7.2-7.3溶解氧为20%搅拌速度为60-75转/分钟。（三）动物细胞生物反应器实验室规模：小于20L的反应器，培养工艺研究中试规模：20-100L的反应器，提供一定量的产品，共纯化、临床前的各种检测和临床观察，工艺优化实验等的需要生产规模：大于100L，1000L居多，最大达8000L，用于生产，提供产品85⒈搅拌式生物反应器最经典、最早用于动物细胞培养的反应器通气好，搅拌剪切力小，有利于长时间，高密度培养主要用于悬浮细胞的培养、微载体培养、微囊培养以及结团培养最早于1984年由英国科学家Spier发明。该装置的主要特点是可以避免在向培养基中通气时气泡直接损伤细胞。同时在采用微载体系统培养时，微载体不会被由于通气所产生的泡沫滞留在气液界面中。NBS则在该研究成果的基础上做了进一步的改进，并于1987年前后将其作为商品推向国际市场笼式通气搅拌器的改进--NBS装置作为对最初设计的笼式通气搅拌器的改进，NBS装置中分别包括笼式的通气腔和消泡腔。气液交换在由200目不锈钢丝网制成的通气腔内实现；而在鼓泡通气过程中所产生的泡沫经管道进入液面上部的由200目不锈钢丝网制成的笼式消泡腔内，泡沫经钢丝网破碎分成气、液两部分，达到深层通气而不产生泡沫的目的。⒉气升式生物反应器没有搅拌，气体通过喷管进入剪切力更小主要用于悬浮细胞的分批式培养，近年开发用于贴壁细胞的微载体培养，并进行半连续、连续和灌流式培养气升式细胞培养反应器不仅在植物细胞培养中应用广泛,而且在动物细胞培养中也取得了很大的成功。和搅拌式生物反应器相比，气升式反应器中产生的湍动温和而均匀，剪切力相当小；同时反应器内无机械运动部件，因而细胞损伤率比较低；反应器通过直接喷射空气供氧，氧传递速率高；反应器内液体循环量大，细胞和营养成分能均匀分布于培养基中。3.固定床或流化床式生物反应器反应器内装不锈钢、玻璃珠、玻璃环、光面陶瓷、塑料或有孔的陶瓷、玻璃、聚氨酯塑料等载体Verax公司推出的CF-IMMO培养系统（右图）专用于比重较大的多孔微球的培养4.膜式生物反应器培养分为两室或三室，培养基与细胞用滤膜分开既可用于贴壁细胞培养也可培养悬浮细胞优点：可使细胞达到很高密度；可随意组合进行操作，达到保留和浓缩产品或及时分离提纯产品的目的（四）动物细胞大规模培养的操作方式分批操作(batch)半连续式操作(semi-continuous)连续式操作(continuous)：除个别情况下用于悬浮细胞的培养生产外，一般用灌流培养来代替。灌流式操作(perfusion)（五）、动物细胞培养国内外生产现状上个世纪80年代，培养细胞密度最大达到2×106/ml，生产期7天，特异产物量为50mg/L。2004年，细胞密度最大可达到10×106/ml，有效表达时间达到3周，表达量接近5g/L，是1980的100倍现在世界上最大的细胞发酵罐达到2万升。哺乳动物细胞生产体系还需要解决的其他问题包括无血清培养基、延迟细胞凋亡和糖基化改进等

生产能力不足已经成为细胞表达的重组药物发展的瓶颈。以Enbrel为例，在1998年上市6个月内仅美国销售就超过对全球整年需求的预计，生产规模缺口很大。又如，HIV蛋白微球（microbicides）在局部使用可以防止HIV传播，但至今未进入临床研究，原因也是生产量不够

。还有很多药物不仅发展中国家用不上，即便是发达国家也难以使用，估计有80%的血友病患者无药可用，主要是生产能力不足。生产能力不足也导致其价格不菲。国外占主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，为提高细胞的产率，可采用流加或灌注培养及微载体培养等相关技术Genentech公司使用CHO细胞以12,000L搅拌式生物反应器培养槽生产t-PA重组蛋白以及治疗癌症的生物药物。Gibco公司建立的流加悬浮培养CHO表达β-Gal系统，采用化学修饰的无蛋白CHO细胞培养基并增加TCA循环，生物反应器中活细胞密度最高可达107/ml。我国动物细胞工程制药的目标(1)建立动物细胞大规模培养的技术平台。该平台是基因工程药物、单克隆抗体及疫苗等产品的关键，由以下几个要素构成：1)高效的真核细胞表达系统。CHO表达的外源蛋白最接近天然构象，是最为想的表达系统，但存在表达量低、大规模培养困难、生产成本高昂等问题。对细胞本身的生理特征进行改造，除了要求目的蛋白的表达量高外，必须适应无血清培养基培养，具有即抗细胞衰老凋亡能力；2)性能优越的、个性化的细胞培养基，包括低血清培养基、无血清培养基；3)先进的生物反应器设备；四军大采用5LCelliGen反应器连续灌注培养杂交瘤细胞，培养第9天细胞密度达到8×106/ml以上目前国内未见有万升级的生物反应器用于生产的报道同时我国有关商品化大规模动物细胞反应器产品还处于空白，有待于进一步改进现有生物反应器，设计或设计新型的生物反应器。目前，百泰药业的哺乳动物细胞培养生产线，是目前中国规模最大、设施最完备、技术最先进的大规模细胞培养技术平台(2)减少污染风险、提高产品质量和安全性；(3)实行“动物药厂”计划，尽快实现转基因动物乳腺生物反应器的产业化；(4)发展下游工程，主要是转基因表达产物及产品的分离纯化，在提高产品的纯度和产量同时，降低成本。总之，我国动物细胞工程制药目前仍处于起步阶段，还有很大差距，虽然目前可生产多种有重要价值的蛋白质生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等，但大部分还处于实验和临床阶段。九、动物细胞工程的实例组织纤溶酶原激活剂（t-PA）生产工艺

1、组织纤溶酶原激活剂（t-PA）生产工艺组织纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶，属单链糖蛋白，它可使组织纤溶酶原活化成纤溶酶，而纤溶酶可水解纤维蛋白，因此组织纤溶酶原激活剂对血栓具有治疗作用。培养基---Eagle培养基，加入青霉素100U/ml、链霉素100U/ml、10%小牛血清。（1）工程细胞构建（2）细胞培养（3）t-PA抗体的制备（4）抗t-PA的亲和吸附剂的制备[A]、Sepharose4B的活化[B]、抗t-PA亲和吸附剂（t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和吸附剂）的制备（5）t-PA的分离（6）t-PA的精制（1）工程菌构建人肺组织提取总RNA↓由mRNA转录成cDNA↓特异性扩增t-PA基因↓鉴定脂质体法转染CHO细胞工程细胞（2）细胞培养取5L玻璃转瓶，按每平方米表面积2.5L的比例加入Eagle细胞培养液。

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将工程细胞按常规方法消化分散、洗涤、计数、稀释成细胞悬液。

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将细胞悬浮液接种到转瓶之中，接种浓度为3*103个/ml

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置于CO2培养箱中，37℃下培养、通入含5%CO2的无菌空气

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等到长成致密单层之后，弃去培养液，

用PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液洗涤细胞单层2-3次。

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换入无血清Eagle培养液继续培养

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每隔3-4天收获一次培养液，用于制备t-PA。

同时向转瓶中加入新鲜培养液继续培养

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如此反复，可获得大量t-PA。（3）t-PA抗体的制备取人t-PA、或者猪心t-PA

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按每只家兔200-300ug的计量，t-PA采用福氏完全佐剂充分乳化，注射入家兔皮下。

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每隔2周再用t-PA100ug进行加强免疫，共加强2次

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取家兔血清

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用50%硫酸铵盐析

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沉淀物于0℃下，用生理盐水透析

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经过Sephadex75柱层析

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得到抗t-PA的免疫球蛋白IgG备用（4）抗t-PA的亲和吸附剂的制备[A]、Sepharose4B的活化[B]、t-PA的亲和吸附剂（IgG-Sepharoes4B亲和吸附剂）的制备

[A]、Sepharose4B的活化Sepharose4B用10倍体积的蒸馏水（V/V）多次漂洗、布氏漏斗抽滤

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取20克Sepharose4B湿凝胶放入500ml的三颈烧瓶中，加蒸馏水30ml，搅均匀后，用2mol/L的NaOH溶液调节PH=11，降温至18℃

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在通风橱中，另取溴化氰1.5g于乳钵中，加入30-40ml蒸馏水分多次研磨溶解

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将溴化氰溶液倒入三颈烧瓶中，升温至20-22℃，同时滴加2mol/L的NaOH溶液调节PH=11-12

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等反应液PH值不变时，继续反应5分钟，取出烧瓶，向其中投入小冰块降温，用3号垂熔漏斗抽滤

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用300ml、4℃、0.1mol/L的NaHCO3溶液洗涤。然后用300ml、PH=10.2、0.025mol/L的硼酸缓冲液分3-4次抽滤洗涤

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最后转移至250ml的烧瓶中，加入50-60ml的硼酸缓冲液，即得活化的Sepharose4B，备用[B]、t-PA的亲和吸附剂（IgG-Sepharoes4B亲和吸附剂）的制备

取抗t-PA的免疫球蛋白IgG，70-80mg溶于20ml硼酸缓冲液中、过滤。滤液加入到已经活化的Sepharose4B中，10℃下搅拌反应16-18小时

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第二天装柱，用10倍柱床体积（V/V）、PH=10.2的硼酸缓冲液，以5-6ml/min的流速洗涤柱床。收集流出液，测定其A280

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用5倍柱床体积（V/V）的、PH=10.0、0.1mol/L乙醇胺溶液洗涤柱床

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用5倍柱床体积（V/V）的、PH=8.0、0.1mol/L硼酸缓冲液洗涤柱床

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用5倍柱床体积（V/V）的、PH=7.4、0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤平衡。

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直到流出液的A280小于0.01，所得到的固定化抗t-PA的免疫球蛋白IgG，就是待提取的t-PA的亲和吸附剂。

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将其转移至含0.01%NaN3的、PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液中，于4℃下贮存，备用。（5）t-PA的分离

步骤-2中所收集到的培养液中，加入蛋白酶抑制剂aprotinin至5万单位/ml。加吐温-80至于0.01%、过滤、除去沉淀.滤液稀释3倍

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稀释液上柱，以5ml/min的流速进入IgG-Sepharoes4B亲和柱（直径4cm*长度40cm）。

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用含0.01%的吐温-80+2.5万单位/ml的蛋白酶抑制剂aprotinin+0.25mol/L的KSCN的PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液以同样的流速洗涤亲和柱，以除去杂蛋白

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最后用3mol/L的KSCN溶液洗脱亲和柱，

以每管10-15ml的体积进行分区收集

合并t-PA的洗脱峰，

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装入透析袋内，埋入到PEG20000中浓缩至原体积的1/10-1/5。

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各t-PA粗提物（6）t-PA的精制

t-PA粗提物

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进Sephadex-G-150柱（直径2cm*长度100cm）

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用含0.01%的吐温-80的1mol/L的NH4HCO3溶液以2-3ml/min的流速进行洗脱

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以每管10-15ml的体积进行分区收集

合并t-PA的洗脱峰，

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于冻干机中进行冻干

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得t-PA精品第二节、植物细胞工程制药基本技术一、植物细胞工程概况二、植物细胞工程制药基本技术三、植物细胞工程应用一、植物细胞工程概况植物细胞培养----植物组织和细胞培养是指在无菌条件、人工控制的营养和培养基、人工控制的环境条件如光照、温度下，研究植物的细胞、组织、器官，以及控制其生长发育的技术。1、植物细胞培养基本概念细胞的全能性:

一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。植物干细胞：植物胚性细胞（embryogeniccells）合子。分化的根茎叶中仍保留少数未分化或分化程度不高的细胞（遗留的胚性细胞）细胞的脱分化（dedifferentiation):特定条件下，分化细胞被诱导，基因活动模式发生变化，改变原有的发育途径，失去原有的分化状态，转变为具分生能力的胚性细胞。已分化的细胞要表现全能性，首先要脱分化形成分生细胞，然后再分化形成胚胎发育成植株脱分化条件：创伤和外源激素。外植体(explant)：植物体上取出的用于培养和分离细胞的组织或器官愈伤组织：植物的伤口或外植体的伤口长出的脱分化细胞的薄壁细胞团。再分化：脱分化细胞再度分化形成另一种或几种细胞、组织器官，并最终再生成完整植株的过程。Callus毛状根(hairyroot)：受到发根农杆菌感染后形成的根组织，易于培养，改变了植物的次生代谢。毛状根生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于从木本植物和难于培养的植物中得到较高含量的次级代谢产物。毛状根具有如下特点：激素自养，不必加外源激素；次级代谢产物含量高且稳定；增殖速度快。毛状根植物细胞的培养特性：（1）植物细胞较微生物细胞大得多，具有纤维素细胞壁,但细胞壁骨架非常脆弱。（2）植物培养细胞重量增加主要取决于对数期，次生代谢产物大多在稳定器积累。（3）细胞具有群体效应、无锚地依赖性和接触抑制性，在细胞生长的中期和对数期，容易凝聚成直径达350-400um的团块，悬浮培养比较困难。（4）培养时需要供氧，培养液粘度较大，不能耐受强力通风搅拌。（5）培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染、需要用抗生素。（6）细胞培养产物多数滞留于细胞内，产量较低。1902年，德国Haberlandt提出了细胞全能性学说，并进行了植物叶肉细胞、髓细胞、腺细胞、气孔保卫细胞、表皮细胞的培养试验,奠定了细胞工程的基础。之后至30年代，建立了基本的植物组织培养技术2、植物细胞工程发展历史50年代期间，植物细胞工程进入新的阶段培养基的设计生物反应器培养动力学等用于次级代谢产物的调控研究80年代后，高速发展时期分子生物学技术改变植物遗传特性植物细胞培养技术进行有药用价值的天然产物的工业化生产和直接生产次生代谢产物成为主流目前，我国处于此方面的领先可供培养的植物种类（1）到目前为止，有研究显示，近300种植物的细胞培养物能够产生400多种有效的药用成份。（2）许多药用植物如人参、长春花、紫草、甘草、紫杉、银杏、黄连等，其细胞培养十分成功。（3）据初步统计，有约30种化合物在培养细胞中的含量已经超过1%，如紫草素的含量可达12%、小檗碱的含量可达1%，人参皂苷可达7%。目前现存的问题（1）技术工艺还不够成熟。（2）提高单位培养基中有效物质的产量（3）降低目的产物的生产成本（4）改进培养条件（5）筛选高产细胞株（6）研制适合于植物细胞培养的新型反应器三、植物细胞工程制药基本技术（一）植物组织和细胞培养技术：植物材料的准备和处理、培养基、培养方法（二）植物细胞种质保存技术（三）植物原生质体培养技术（四）植物细胞融合技术（五）转基因技术（略）（一）植物材料的准备和处理用于植物组织培养的外植体，必须是无菌材料。因此在培养之前，必须对外植体进行严格的灭菌处理。植物不同的组织，所需要的灭菌步骤也各不相同

1、常用的灭菌试剂2、灭菌步骤1、常用的灭菌试剂次氯酸钙 9-10% 5-30分钟

次氯酸钠 0.5-5% 5-30分钟

过氧化氢 3-12% 5-15分钟

溴水 1-2% 2-10分钟

硝酸银 1% 5-30分钟

氯化汞 0.1-1% 2-10分钟

抗生素 4-50mg/L 30-60分钟

最常用的是----次氯酸钠、次氯酸钙、氯化汞。（二）培养基1、植物细胞的营养需求2、培养基的组成成份3、培养基的配制原则和常见的培养基类型1、植物细胞的营养需求（1）无机营养物---N、P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo（2）维生素---维生素B1、B6，烟酸、肌醇、生物素、泛酸钙、叶酸。（3）碳源---蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露醇、山梨醇。（4）天然物---水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取物、香蕉汁、荸荠汁、苹果汁。（5）氨基酸类---甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、天冬酰氨、酪氨酸、精氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、胸腺嘧啶。（6）核酸及其水解物---DNA、RNA、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶。（7）植物激素：生长素类---吲哚乙酸（IAA）、2,4-D、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、细胞分裂素类---6-苄氨基嘌呤（BA）、玉米素（ZT）、激动素（KT）。其它激素类---乙烯、赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）、油菜素内酯、独脚金甾醇、水杨酸、茉莉酸（8）其它成份---氯化胆碱、胆质素、苹果酸、反丁烯二酸、固形剂、琼脂。（一）无机盐大量元素：氮、磷、钾、钙、镁、硫等微量元素：硼、锰、锌、钼、铜、钴、氯等（二）生长因素植物生长调节剂植物生长激素：生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱落酸，乙烯。

借生长激素调控生长分化，以及细胞培养时，获得最大量的次生代谢产物生长素（用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和根的分化）：组织培养中常用的有：吲哚乙酸(IAA)：第一个被发现和人工合成的的激素二氯本氧乙酸(2,4-D)；萘乙酸(NAA)；吲哚-3-丁酸(IBA)；萘氧乙酸(NOA)；对氯苯氧乙酸(P-CPA)NAA、IAA、IBA易引起生根，2,4-D有利于愈伤组织的诱导和生长细胞分裂素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。常用的有：6-苄基嘌呤(BAP)6-苄基腺嘌呤(6-BA)激动素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT）玉米素(zeatin、zt)异戊烯氨基嘌呤(2-ip)植物培养物的生长取决于生长素和分裂素的比例：高浓度生长素和低浓度分裂素——刺激细胞分裂

低浓度生长素和高浓度分裂素——刺激细胞生长（三）诱导子(elicitor)：刺激植物细胞合成防御性次生代谢产物的物质,可以通过改变次生代谢途径中催化酶的酶活力,引起代谢通量和反应速率的改变,提高次生代谢产物的产量。

非生物诱导子：水杨酸，茉莉酸等,稀土及重金属盐类生物诱导子：微生物类，如真菌孢子，菌丝体

真菌培养物滤液等（四）碳源细胞培养过程中不进行光合作用，需提供糖做碳源。（五）维生素：烟酸，B1，B6（六）有机物：甘氨酸或水解络蛋白，酵母提取液等。3、培养基的配制原则和常见的培养基类型（1）培养基的配制原则母液配制时各成份浓度应该比实际使用浓度扩大一定倍数，使用时稀释。培养液应该维持PH值恒定，常用1mol/L的HCl、或者1mol/L的NaOH进行调节。培养基分装之后，处加棉花塞和牛皮纸包扎，在82.74--1030.42kPa压力下、121℃下、消毒灭菌20min、冷却之后就可以用于接种。（2）常见的培养基类型MS、N6、B5、改良White（三）培养方法（I）植物细胞的获得（II）植物细胞培养方法（II）大规模工业化生产方法（I）植物细胞的获得1.外植体直接分离法:机械切割、组织破碎直接从植物外植体中分离2.愈伤组织分离法：从愈伤组织制备小细胞团或单细胞悬液3.原生质体再生法：纤维素和果胶酶混合处理外植体或愈伤组织，分离原生质体，再生培养基中培养，原生质体细胞壁再生获得植物细胞（II）植物细胞的培养类型

按培养对象分1.单细胞的培养：从外植体、愈伤组织、群体细胞或细胞团中，分离得到单细胞，然后在一定条件下进行培养的过程。（1）看护培养法（nurseculture）：在单细胞的生长环境里加入愈伤组织同时培养。愈伤组织提供促细胞分裂的物质等，传递生物信息，使持续分裂增值等。即愈伤组织看护单细胞（2）微室培养法：将含有单细胞一小滴液体或固体培养基接种到小室里，密封培养。（3）平板培养法：将单细胞悬液调整到临界密度，接种于加热熔化后刚冷却至35℃左右的固体培养基中充分混匀，分装后培养。（4）条件培养法：接种于条件培养基上形成的细胞系。条件培养基指培养过细胞的培养基上清，有植物生长激素等残留，用于制备成固体培养基。（5）悬浮培养法：将单细胞接种到液体培养基中振荡培养。2.单倍体细胞的培养（花药培养）：指将植物单倍体细胞培养成单倍体植株或纯和二倍体植株一般采取花药作为单倍体细胞的培养对象用花粉在固体培养基上培养3.愈伤组织培养愈伤组织既是组织又是细胞，为脱分化细胞，具再分化的能力，可用于次生代谢物的生产，也可再生为植株4.小细胞团培养将同步化的2-8个细胞组成的小细胞团接种于培养基上进行培养。5.毛状根诱导和培养一些次生代谢产物只有在根里生长发根农杆菌感染双子夜植物，RI质粒诱导产生毛状根。形态方面：Ri质粒诱导快速生长的、非定向性、高分支的毛状根的形成代谢方面：Ri质粒转化根能合成与原植物相同或相似的次生代谢物，并且发根合成次生代谢物具有遗传稳定性。植物细胞生物反应器植物细胞易聚集化，比较脆弱，代谢途径和代谢产物累积与细胞生长关系的复杂性，选择合适的培养方法和反应器影像产物产量细胞培养周期长，次生代谢产物含量相对较低，提取困难，生物反应器技术还有待深入植物细胞反应器类型1、通气搅拌罐式反应器2、鼓泡塔式反应器3、气升式反应器4、振动混合式反应器5、恒化反应器6、平板反应器7、中空纤维反应器8、膜式反应器9、填充床反应器（PBR）10、流化床反应器各种生物反应器性能比较不同类型的生物反应器各有其优缺点，而改进的搅拌式生物反应器和气升式反应器可能更适合植物细胞的培养。一般来说，悬浮培养的细胞在干重不大于20g/L时，以气升式反应器为宜，而当干重超过20g/L时，则改进的搅拌式生物反应器优于其它类型的反应器我国发明的“气升内错流”式植物细胞培养反应器，能够适应植物细胞培养周期长，培养液随培养进程而蒸发减少的生物反应过程；可抑制气泡的聚合，减弱气泡在液面破裂时产生的冲击力对细胞的损伤；可提高降液区气含率，消除降液区缺氧现象，并强化混合与氧传递，大大降低反应器高度。使用这种反应器培养新疆紫草细胞，培养结束时细胞量达到12gdw／L，紫草宁含量达到了细胞干重的10％，是天然植株含量的2～8倍培养方式和操作方法悬浮培养（1）成批培养法（2）半连续培养法（3）连续培养法固定化培养法（1）成批培养法[A]、定义----将培养基一次性地加入到反应器之中、接种、培养一定时间之后，收获细胞的操作方法。[B]、实例----1953年Tulecke设计了一个20L的培养瓶，并利用这个系统培养了银杏、冬青、黑麦草、蔷薇等植物细胞。日本人发明了二步培养法，第一步用于细胞数量的增殖，第二步则用于次级代谢产物的街道，他们成功地生产出第一个植物细胞工程产品----紫草素。（2）半连续培养法[A]、定义----在反应器中投料、接种培养一段时间之后，将部份培养液放出，同时放入等量的新鲜培养液进行置换的方法，称为半连续培养法。[B]、基本步骤----每隔1—2天收获一部份培养物，最多可达50%，然后再加入新鲜培养液，通过调整收获次数来维持细胞重量的恒定。[C]、实例----1972年，Kato用大规模半连续培养方法生产烟草细胞。（3）连续培养法[A]、常规连续培养法是指利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间之后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样的速度供给新鲜培养基、使得细胞生长环境长期维持恒定的方法。优点----其细胞的生产能力要比成批培养法高。缺点----由于细胞培养时间长，要维持系统长时间的无菌状态，技术条件要求较为苛刻。[B]、二阶段连续培养法设置二个培养罐，第一罐中投入生长培养基用于实现细胞增长，生产过程中进行连续投入。第二罐中投入生产培养基用于生产细胞次级代谢产物。二罐间通过管道连接。第一罐中的产物流到第二罐，第二罐的产物定期放出。优点-----可大提高细胞生长速度。实例-----生产烟草细胞，第一罐中投入含N的生长培养基，第二罐中投入低N的生产培养基。细胞生长速度达6.3mg（干重）/L.h。（4）固定化培养法固定化培养法是先将植物细胞固定在特制的固定化反应器中，然后放入培养基中进行培养，或者连续流入新鲜的培养液进行连续培养，同时通往净化空气代替搅拌，最后收集培养产物的方法。种类---网状多孔板、尼龙网套、中孔纤维膜。优点---细胞位置相对固定、易于获得高密度细胞群体、能够维持细胞间的物理化学梯度、有利于细胞组织化、易于控制培养条件、还有利于获得次级代谢产物。实例---将辣椒细胞固定于聚氨基甲酸乙酯泡沫中，结果细胞生命力维持在23天以上。辣椒素产量较悬浮培养法高出1000倍。（二）植物细胞种质保存技术1、细胞种质保存的意义（1）植物细胞在继代培养过程中常常导致染色体突变和基因型变异等现象，致使细胞失去全能性和某些有益性状，为此有必要对种质加以保存。（2）自然界中多种植物濒于灭绝，需要建立人工种质库。2、细胞种质的常规保存方法（1）干燥保存法 （2）液体石蜡覆盖法（3）低温保存法 （4）低压低氧保存法以上方法都属于常规保存方法，其原理主要是通过脱水、减少氧气供应、降低温度、抑制细胞生理活动、延缓细胞衰老等等手段来延长保存时间。其缺点是难以完全抑制细胞的生命活动，被保存的细胞仍然会发生遗传性变异。3、超低温冷冻保存法这是保存植物细胞的最佳方法，将植物种质细胞保存在-196℃的液氮之中。在这样的温度条件下，细胞的代谢与生长完全停止，也就还会引起遗传性状发生变异。目前，植物的愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、花粉、花粉胚、体细胞、胚状体、茎尖分生组织、小植株、茎芽等等组织均已经在液氮中保存成功。超低温冷冻保存的具体步骤如下：（1）冰冻保护剂（2）材料预处理（3）降温与冻结（4）细胞复苏（5）深冻细胞的活力和存活率测定（1）冰冻保护剂常用的冰冻保护剂有：二甲亚砜（DMSO）、甘油、聚乙二醇（PEG）、葡萄糖、山梨糖、蔗糖等等。几种冰冻保护剂复合之后的保存效果要比单一成份的保存效果好。例如：单用5-10%的DMSO保存长春花培养细胞，其存活率为5-8%。而采用5%DMSO+1mol/L山梨醇复合液保存长春花培养细胞，其存活率为61.6%。（2）材料预处理取材就尽量安排在冬季，取材时应选择抗冻能力强的幼龄培养细胞。实验材料应进行低温预处理：[A]、将材料在含有山梨糖醇+脱落酸的培养基中预培养，以诱导其抗寒能力。[B]、将细胞在5-10%的DMSO培养液中，于0℃预处理1小时，以提高细胞存活率。（3）降温与冻结[A]、快速冰冻法----将那些经过-3℃到-10℃预处理20天的细胞培养物和其它材料一起，直接投入到液氮之中，令细胞迅速度过-10℃到-140℃之间的崩解危险期，冻结后的细胞呈玻璃态，冰晶不再生长，从而使得细胞不会被破坏。此方法多用于保存种子、花粉、球茎、块根、冬芽等高度脱水材料。[B]、慢速冰冻法----是指将材料按每分钟下降1℃到10℃的降温速度进行慢速冰冻。此法适用于保存那些不耐寒的植物。[C]、二步冰冻法----将植物先通过慢速降温至-30℃到-50℃，等达到一定程度的保护性脱水之后，再投入液氮之中迅速冰冻。此法适用于保存长春花、人参、烟草、胡萝卜等悬浮培养细胞和愈伤组织。（4）细胞复苏细胞复苏也称为细胞化冻过程，大多数材料均采用快速化冻方法，只有木本植物的冬芽需要采用慢速化冻方法。可分为二种不同的方法。[A]、快速化冻----将冻块放置在35-40℃的环境下直接融化，称为快速化冻。[B]、室温慢速化冻----先将冻块放置在0℃的环境中，然后逐步升高温度，使其融化，称为慢速化冻。（5）深冻细胞的活力和存活率测定[A]、再培养法----将复苏后的细胞接种于新鲜培养基上进行再培养，同时测定细胞的增值量、愈伤组织形成情况、和细胞分化为新植株的能力。再培养法是检查细胞活力的根本方法。[B]、二醋酸荧光素染色法：方法---采用1滴0.1%的荧光至少染料溶液+1滴化冻之后的细胞悬混液进行混合。由于活细胞能够染色、而死细胞则不着色，采用普通显微镜计录细胞总数。再用紫外显微镜计录发出荧光的活细胞数。求百分比计算出细胞的存活率。缺点---只能够作为生活力的预测指标，而不能代替再培养法。[C]、氯化三苯四氮唑还原法（TTC法）：原理---活细胞内含有脱氢酶，能够将氯化三苯四氮唑还原为红色物质formazan，而此物质只溶于乙醇、而不溶于水。方法---将氯化三苯四氮唑+冻存的植物细胞进行保温反应，然后用乙醇抽提。再用分光光度法测定其吸光度。缺点---只能够作为生活力的预测指标，而不能代替再培养法。（三）植物原生质体培养技术1、原生质体以及制备步骤2、原生质体的培养3、原生质体培养的意义

1、原生质体及其制备步骤原生质体----去除细胞壁之后的，仍然具有生命活力的裸体植物细胞，称为原生质体。原生质体也具有结构和功能的全能性。原生质体经过诱变，也能产生突变体细胞。原生质体的制备步骤：（1）材料来源（2）材料预处理（3）制备原生质体所需要的酶类（4）原生质体的制备（5）原生质体的纯化（6）原生质体的活力测定（1）材料来源植物的各种组织器官均可以作为原生质体的材料。

首先选用叶片、愈伤组织、悬浮培养细胞。

其次选用茎尖、根尖、子叶、胚性组织细胞。

叶片----取材方便，遗传性一致，但是培养条件较为苛刻。

悬浮培养细胞----培养条件容易控制、实验重复性好，但是易产生染色体倍性变异。（2）材料预处理预处理的目的------为了减轻对于原生质体膜的损伤，提高原生质体的获得率。预处理的原理------通过物理化学方法，来改变细胞的生理状态和细胞壁的化学成份。使其容易进行质壁分离。预处理的方法------共有5种方法：（A）质壁预分离将愈伤组织或悬浮培养细胞置于17-20℃酶液中静置半小时，再于28-34℃保温，可达到质壁分离的目的。将材料置于相同浓度的酶液+糖液之中，预培养1小时左右，再浸于酶液中消化，可达到质壁分离的目的。（B）预培养----将除去表皮的叶片于诱导愈伤组织培养基上培养7天，再用酶消化脱壁，可使得质壁分离频率较高。（C）暗处理----将室温下生长5-7个星期的植物材料于黑暗中放置30小时以上，取其叶片所制备的原生质体具有较高活力。（D）光处理----将叶片于日光或者灯光下照射2-6小时，令其萎蔫，然后取其叶片所制备的原生质体，具有较高活力。（E）低温处理----萌动的种子在4℃下过夜，然后再播种，再从其植株的叶片上分离出的原生质体，具有较高的活力。（3）制备原生质体所需要的酶类纤维素酶----OnozukaR-10、RS、EA3-867。果胶酶（又称离析酶）----MacerozymeR-10、PectalyaseY-23。崩溃酶----Driselase半纤维素酶----RhozymeHP150蜗牛酶

以上酶类，在进行酶液配制时，需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、CaCl2-2H20、KH2PO4等渗透稳定剂，以维持原生质体的完整性。所配制的酶液，其pH值应维持在5.4-5.6为宜，降至4.8以下则原生质体就会发生破裂。酶液配制之后不能进行加热灭菌法操作，而应该采用0.45um的微孔滤膜过滤灭菌。（4）原生质体的制备（A）机械法分离----产量较低。（B）一步酶消化法----将材料在21--28℃之间，用纤维素酶+果胶酶温合液一次性处理2—24小时。（C）二步酶消化法----先用果胶酶来降解细胞间胶层、获得单细胞，再用纤维素酶脱壁而释放出原生质体。（5）原生质体的纯化酶消化后的原生质体含有多种杂物，如叶脉、表皮、各种细胞器。需要进行纯化操作。原生质体纯化方法有4种：（A）离心法----原生质体混合物用500-1000r/min离心5min，吸去上层液，沉淀物用酶消化液反复洗涤3-4次，最后用原生质体培养液洗涤即可。（B）飘浮法----采用20%的蔗糖溶液进行离心，结果原生质体飘