基础生化实验 第三个实验 双缩脲

基础生化实验--双缩脲法测定蛋白质含量双缩脲法测定蛋白质含量（考核实验）一、教学目的与要求：①加强对蛋白质的有关性质的认识；②掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法；③对学生所学进行综合的测试。二、教学实验原理：蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量氨基酸成分无关，因此利用此进行比色测定蛋白质含量。在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540—560nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知的蛋白质浓度，标准蛋白溶液可以用结晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。除-CONH-有此反应外，-CONH2-，-CH2-，NH2-，-CS-CS-NH2，等基团亦有此反应。三、考核主要内容1、标准曲线的制作取6支干净的试管，按0→5编号，然后按下表依次加入试剂，充分混匀，在室温下放置半小时，以管为空白，在550nm波长处测定消光值（OD），以各管蛋白质含量（毫克）横坐标，OD值为坐标，画出标线。编号012345蛋白质标准液（毫升）00.20.40.60.81.0蒸馏水（毫升）1.00.80.60.40.20双缩脲试剂（毫升）4.04.04.04.04.04.02、样品测定：取样品液1.0ml，同法进行，测其OD值，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。3、分光光度计的使用：规定每组在10min以内全部完成操作（共测6支管）；同时注意操作是否规范。4、成绩的计算：此次的实验占30%（包括平时的表现及实验报告的完成情况和完成质量），平时的五次实验共占70%，每次实验按总分为5分为满分进行打分，总评折合成百分制。四、实验注意事项：①标准样品的浓度为：10μg/ml；②实验过程中不得过问他人，同组人可以配合进行；③实验报告在课堂上独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他人数据，一旦发现以零分处理；④实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做；⑤对实验结果进行简单的分析.一、实验目的：1.掌握分光光度计的使用方法。2.掌握标准管法测物质含量的方法。3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法。二、实验原理：双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色化合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法进行测定。双缩脲法最常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。三、试剂和器材（一）试剂:1.标准蛋白溶液（5mg/ml）:准确称取已定氮的酪蛋白(干酪素或牛血清白蛋白)用0．05mol/L氢氧化钠溶液配制，冰箱存放备用。2.双缩脲试剂:溶解1.5g硫酸铜晶体(CuSO4·5H2O)和6.0g酒石酸钾钠晶体NaKC4H4O6·4H2O)溶于500ml蒸馏水中，在搅拌下加入300ml10％氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml，贮存于内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存。3.样品血清:动物血清用水稀释10倍，置于冰箱保存备用。标准曲线法所用的血清需20倍稀释。(二)器材:分析天平、分光光度计、恒温水浴箱、试管、吸量管等四、实验方法：1.取三支试管按下表操作：试管号空白管标准管测定管血清(ml)001.0标准蛋白(ml)01.00蒸馏水(ml)2.01.01.0双缩脲试剂(ml)4.04.04.0A540nm

2、摇匀，37℃水浴20min