细胞生物学综合性实验报告

植物原生质体的分离、纯化及融合引言原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生成完整植株。分离原生质体采用酶解法。其原理是根据由纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组分，以及原生质体收集方法有关。酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯既，然后进行培养。不同种植物的原生质体可在人工诱导条件下融合，所产生的杂种细胞，即异核体经过培养可再生新壁，分裂形成愈伤组织，进而分化产生杂种植株。由于进行融合的原生质体来自体细胞，故该项技术也叫体细胞杂交。原生质体融合能使有性杂交不亲合的植物种间进行广泛的遗传重组，因而在农业育种上具有巨大的潜力。在植物遗传操作研究中也是关键技术之一。

人工诱导原生质体融合可使用物理学方法，如运用细胞融合仪，在电场诱因导下实现融合，然而至今广为使用的仍是聚乙二醇（PEG）溶液引起原生质体的聚集和粘连，然后用高pH钙溶液相处理的化学方法（Kao等，1974）。该法应用分子量至为1500~6000的聚乙二醇（PEG）溶液引起原生质体的聚集和粘连，然后用高pH的钙溶液稀释时，就产生了高频率的融合，融合的频率和省略常与所有PEG的分子量、浓度，作用时间，原生质体的生理状态与密度以及操作者的细心程度有关。1材料、试剂与方法1.1材料菠菜叶片,唐古特白刺愈伤组织,金盏菊花瓣。1.2试剂1.70％酒精。2.0.1％升汞水溶液，并滴入少许TWeen80。3.灭菌蒸馏水。4.0.16mo／L和0.20mo／LCaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。5.20％和12％蔗糖溶液，pHPH5.8~6.2。6.酶液A纤维素酶(cellulase，OnozukaR-102％果胶酶(13ectinase，Serva)1%(若用国产EA3-867纤维索酶，则果胶酶可省去。)甘露醇0.6mol／LCaCl2·2H2O0.05mol／LMES0.1％pH5．8～6．27．酶液B纤维素酶(OnozukaR-10)2％离析酶(MacerozymeR-10)1％半纤维素酶(hemicellulase，Sigma)0.2％甘露醇0.4mol／LCaCl2·2H200.1％MES PH5.8～6.28．PEG溶液9.高pH，高钙稀释液1.3方法1.3.11.取充分展开的叶片和花瓣，用自来水冲洗干净。(以下步骤均在超净台上进行)。2.将叶片在0·1％升汞溶液中浸泡灭菌10min，中间摇动几次。取出后用无菌蒸馏水漂洗5次3.将叶片移入大培养皿中，用吸水纸吸去上面的水珠。然后将叶背面朝上，小心用镊子撕去下表皮。1.3.24.将撕去下表皮后的叶片放进预先放有酶液A的培养皿或带盖兰角瓶中，每10ml酶液约放2g叶片。若叶片不易撕下下表皮，可用锋利的解剖刀将叶片切成约0.5mm宽的小条，放入酶液。5.将培养皿用石蜡膜带封口，在28℃条件下保温3～6h，中间轻轻摇动2～3。在倒置显微镜下检查，直到产生足够量的原生质体。1.3.6.将酶解后的原生质体悬浮液用不锈钢网筛过滤到小烧杯中，以除去未酶解完全的组织。7.将滤液分装在刻度离心管中，用600r／min的速度离心5min，使原生质体沉淀下来。8.用移液管吸去上清液。将沉淀的原生质体悬浮在2ml0.2mol／L的CaCl2·2H2O中。9.用注射糙伸长针头向离心管生部缓缓注入20％蔗糖溶液6ml，在600r／min下离心5min。此步完成后，在两相溶液的界面之间将出现一层纯净的完整原生质体带，杂质，碎片将沉到管底。10.注射器吸出管底杂质和下部的蔗糖溶液及上部的CaCI2·2H2O溶液。11.离心管中留下的纯净原生质体用8ml0.2mol／L的CaCl2·2H2O悬浮。离心离心5min，吸去上清液。再用培养基如法洗涤一次。1.3.12．将收集的两种不同材料的原生质体分别悬浮在0.16mol/L的CaCl2·2H2O13．将两种原生质体悬液等量混合。14．用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径为60mm的平皿中，每皿滴7~8滴，每滴约0.1ml。然后静置10in，使原生质体贴壁。15．用吸管将等量的PEG溶液缓慢地加在原生质体液滴上，再静置10~15min。此时可取一个平皿在显微镜上观察原生质体间的粘连。16．用刻度吸管向原生质体液滴慢慢地加入高pH、高钙稀液。第一次加0.5ml，第2次1ml，第3、4次各2ml，每次之间间隔5min。17.将平皿稍微倾斜，吸去上清液，再缓缓加入4ml稀释液。5min后，再倾斜平皿，吸去上清液注意吸去上清液时勿使原生质体漂浮起来。18.用PEG培养基如上法换洗二次。19.每平皿中加培养基2ml，轻轻摇动平皿。1.3.520.用蜡膜密封平皿。置260下进行24h暗培养，然后转到弱光条件下培养2结果与分析2.1结果展示图(一)原生质条带图(二)原生质体融合2.2结果分析用聚乙二醇作为诱导剂的情况下，两个植物细胞能够融合，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。3讨论两细胞融合现通常分为五个阶段。①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。参考文献[1]郭晓华,那宁馨.新疆杨组织培养