第五章.分子生物学的研究方法-电泳、杂交

第五章分子生物学研究的主要方法序：重组DNA技术回顾第一节DNA基本操作技术第二节RNA基本操作技术—RNA提取第三节DNA与蛋白质互作第四节基因组技术第五节蛋白质组技术第六节基因克隆技术DNA提取分离核酸的凝胶电泳PCR基因扩增基因定点诱变核酸序列分析核酸分子杂交DNA分子切割与连接1序：重组DNA技术回顾重组DNA技术的诞生

（一）重组DNA技术诞生的理论基础

1.40年代明确了遗传的物质基础是DNA

232、50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制43、50年代末和60年代:“中心法则”、操纵子学说、破译遗传密码5（二）关键性实验技术问世为重组DNA技术奠定基础DNA分子的切割与连接技术DNA序列分析载体构建和大肠杆菌转化体系的建立Southern杂交、和聚合酶链式反应、核酸凝胶电泳。。。。6重组DNA技术的定义及步骤（一）重组DNA技术

1、重组DNA技术（recombinantDNAtechnology):

按照人的意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中稳定地增殖、表达，以大量获得相关基因的产物或新品种新产物。7指由一个细胞通过无性繁殖以后形成的与亲代完全相同的子代群体。分子克隆（molecularcloning）：构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体系。2.克隆（clone):8重组DNA技术的一般步骤目的基因获得功能研究转化载体转入受体细胞9第一节DNA基本操作技术——一、DNA提取分离1．溶液I—溶菌液：溶菌酶：葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用

EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等，抑制脱氧核糖核酸酶；（2）有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

2．溶液II－NaOH－SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。

SDS：（1）溶解膜脂质与蛋白。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性。

提取液离心组织上清液沉淀TE溶液无水乙醇离心RNase103.溶液III：3mol／LNaAc（pH4.8）溶液(质粒DNA）调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。高盐有利于染色体DNA、RNA（中和核酸上的电荷）以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀（钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物）。

4．无水乙醇沉淀DNA：一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇。

5．NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L：中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力。

116．RNase、SDS与KAc/饱和酚、氯仿：SDS可使RNase成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物。

7．T-E缓冲液:DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等都可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀.8.Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统:不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳12二、核酸的凝胶电泳

1.基本原理

2.琼脂糖凝胶电泳

3.脉冲电场凝胶电泳131原理电泳及迁移率核苷酸链为多聚带电阴离子无反应活性的稳定的介质电泳迁移率+142琼脂糖凝胶电泳琼脂糖为线性多糖聚合物，红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，密度由浓度决定的。分辨能力同凝胶的类型和浓度有关:琼脂糖凝胶分辨范围为0．2～50kb之间.15不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力凝胶类型及浓度

分离DNA片段的大小范围（bp）

0.3％琼脂糖50000～10000.7％琼脂糖20000～10001.4％琼脂糖6000～3004.0％琼脂糖1000～10010％琼脂糖500～2520％琼脂糖50～116电泳槽结构17电泳装置18常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.

指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。19溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下红色荧光二甲苯青:水溶液呈兰色，在1%和1.4%琼脂糖中迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA相似.指示剂一般与蔗糖、甘油组成载样缓冲液.①增加样品密度.②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，加样操作更方便20溴化乙锭染色溴化乙锭（ethidiumbromide，简称EtBr）在一切可能的部位同DNA分子结合，却不能同琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶结合,并在300nm紫外光照射下放射出橘红色的光，可显现凝胶中0.05ug的微量DNA

方法：加入凝胶中，凝胶浸泡重要的特性：荧光强度同DNA片段的大小或数量成正比。2122银染银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收23LMP琼脂糖回收DNA分子LMP琼脂糖：一种熔点为62～65℃的琼脂衍生物，熔解后，在37℃可保持液体状态数小时，在25℃可持续保持液体状态约10分钟。回收DNA：将凝胶65℃加热，加入过量的酚，离心，上清液中便含有除去了琼脂糖的DNA。另外，一旦LMP琼脂糖已经熔化，并保持在37℃下，就可直接进行酶催反应。据此，可以对电泳分离的DNA酶切片段进行第二种酶切反应。2425变性胶电泳方法用途26273脉冲电场凝胶电泳DNA大分子的分离：琼脂糖凝胶不能分离大于750kb的DNA。常规凝胶，超过一定大小范围的所有的双链DNA分子，都按相同速率迁移。。1984，Schwartz和Cantor：脉冲电场凝胶电泳（pulsed－fieldgelelectrophoresis，简称PFGE）技术，可分离整条染色体。大分子量DNA需更多次数更换构型和方位，以便按新方向游动。迁移速率慢，可分离到107bpDNA大分子。28“电泳”思考题电泳的原理是什么请说出以下电泳用胶的区别：普通DNA分离、测序胶、Southern杂交比较分子量相同的三种不同构型的DNA（直链线形、闭合环形、开链环形）在同一电场中的电泳迁移率比较溴化乙锭染色和银染的区别说明电泳技术在基因工程中的作用返回第二章29三、核酸分子杂交

1.SouthernDNA印迹杂交

2.NorthernRNA印迹杂交

3.Western印迹杂交

4.菌落(或噬菌斑)杂交

5.斑点印迹杂交和狭线印迹杂交返回第二章301Southernblot根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA