第3章：细胞周期调控系统

第三章：细胞周期调控系统细胞周期调控系统：Cyclin:调节亚基Cdk(cyclindependentkinase)：催化亚基多种控制细胞周期调控系统活化的方式Cdks与Cyclins的结合磷酸化与去磷酸化蛋白质降解基因表达调控CKI的结合空间分布细胞内外信号的协调G1期：转录细胞外（如有丝分裂原）和细胞内的信号（如细胞生长监控系统）可启动G1/S-和S-细胞周期蛋白基因的表达，最终可以激活G1/S-Cdks，新的细胞周期因此开始。G2期：磷酸化与去磷酸化Cdk亚单位的抑制型磷酸化处于无活性的磷酸状态。当有丝分裂开始时，这些磷酸化的突然去除导致了所有M-Cdk的激活，触发了G2/M检验点的转换。M期：蛋白质降解破坏S期和M期细胞周期蛋白——使所有主要Cdks在有丝分裂后半段失活。破坏姐妹染色单体结合在一起的蛋白——染色体分离。细胞周期调控系统的特性：第一，细胞周期调控系统包括反馈环和其他调节的相互作用，使大部分周期蛋白-Cdk复合物产生不可逆的，开关样的激活和失活。因此，细胞周期事件通常是以“全或无”的方式进行，以使细胞避免一些事件的部分激活造成的伤害。第二，不同周期蛋白-Cdk开关的相互调节作用确保它们之间的有序与协调。细胞周期调控系统的特性：第三，细胞周期调控系统极为强大：每个周期蛋白-Cdk开关的激活与失活都能通过多种机制进行调控，使得系统在即使部分组分出现问题的情况下，依然运转良好。最后，系统具有可适应性，在各种细胞内和细胞外的调节因子的作用下，主要调控开关的时间点可以能作出相应的调整。第一节细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶细胞周期蛋白依赖激酶（Cdks）属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族，其成员都是小分子量蛋白质(～34-40kDa)所有的Cdks都有一个共同的特征，即它们酶活性的激活需要结合细胞周期蛋白调节亚单位。大部分情况，Cdks的完全激活还需要靠近激酶活性位点的苏氨酸的磷酸化。一、细胞周期蛋白依赖激酶的特性动物细胞包括至少九种Cdks，其中只有四种（Cdk1,2,4,6）直接参与了细胞周期调控一、细胞周期蛋白依赖激酶的特性Cdk功能在进化中高度保守。如果把酵母的Cdk1基因替换为人的Cdk1，酵母细胞依然能正常增殖。Cdks能磷酸化几百种不同的蛋白质。Cdk蛋白识别的特定序列的丝氨酸或苏氨酸残基。Cdks典型的磷酸化序列是[S/T*]PX[K/R]，其中S/T*是指磷酸化的丝氨酸或苏氨酸，X代表任意氨基酸，K/R代表碱性氨基酸赖氨酸（K）或精氨酸（R）。一、细胞周期蛋白依赖激酶的特性小的氨基端小叶大的羧基端小叶

一个大的可弯曲的环—T-环或激活环—从羧基端小叶伸出，可阻止蛋白底物结合到活性位点缝隙入口处。未激活状态下，Cdk活性位点的很多重要氨基酸侧链定位不正确，使得ATP的磷酸根定向不利于激酶反应。二、细胞周期蛋白依赖激酶的结构T-loopPASTAIRE螺旋(也叫α1螺旋)与细胞周期蛋白直接作用，结合时向内移动，引起与ATP磷酸根作用的残基重新定向。二、细胞周期蛋白依赖激酶的结构第二节细胞周期蛋白Cyclin一：细胞周期蛋白分四类细胞周期蛋白在细胞周期过程中表现出剧烈的浓度变化，以帮助产生Cdk活性的震荡变化，这是形成细胞周期调控系统的基础。细胞周期蛋白基因表达的改变蛋白酶解三个检验点；四类细胞周期蛋白:G1,G1/S,S,MG1/S细胞周期蛋白：在G1期的晚期升高，在S期早期下降

：启动DNA复制，中心体复制S细胞周期蛋白：在S期升高。负责DNA复制，一次M细胞周期蛋白：S-G2-M。负责有丝分裂纺锤体的装配，姊妹染色单体在纺锤体上的排列

G1细胞周期蛋白：浓度并不发生震荡变化，而是随着细胞的生长和细胞外生长调节信号出的存在，在整个细胞周期中的浓度逐渐增加。负责新细胞周期的设定。一：细胞周期蛋白分四类二、细胞周期蛋白的结构不同的一级结构：约100个氨基酸的细胞周期蛋白盒，与Cdk的结合和激活必需。相似的三级结构，称为细胞周期蛋白折叠，包括一个由两个紧密的结构域构成的核心。每个结构域包含五个alpha螺旋。第一个五个螺旋簇对应于保守的细胞周期蛋白盒。第二个五个螺旋簇与第一个螺旋簇相同，尽管序列相似性有限。细胞周期蛋白氨基末端区域的长度尤其不一样，包括了细胞周期蛋白特异的调控和靶向结构域。S细胞周期蛋白和M细胞周期蛋白的氨基末端区域含有短的降解盒基序，能在有丝分裂期靶向蛋白酶解。二、细胞周期蛋白的结构第三节细胞周期调控系统的活性的调节细胞周期调控系统的活性受到多种因素的调节使得Cdk2构象发生变化，最明显的变化发生在T环（T-loop）处，Cyclin的结合也使L12小螺旋转化为β链，使后面的T环发生重构，不再堵塞蛋白底物的结合位点，而是在缝隙入口处几乎平坦排列。一、与cyclin的结合是Cdk活化的基本条件底物的靶向性：Cdks：T-环与底物的SPXK的保守序列作用。细胞周期蛋白：疏水斑与底物上的RXL基序作用Cks1：磷酸根结合袋的存在能使其靶向那些含有多个磷酸化位点的靶蛋白。一、与cyclin的结合是Cdk活化的基本条件决定Cdk的底物特异性。位于cyclin表面称为疏水斑的区域，与含有互补疏水序列称为RXL（或Cy）的基序的底物以中度亲和力结合。cyclin结合的也可以将Cdk带到其底物所在的空间部位。有些cyclin包含有序列信息，能够靶向自身和它们的Cdk同伴到特定的亚细胞部位。一、与cyclin的结合是Cdk活化的基本条件活化磷酸化：不去磷酸化抑制磷酸化：去磷酸化二、磷酸化与去磷酸化是控制Cdk活性的开关步骤(1)Cdk的活化磷酸化:Cdk活化激酶（CAK）催化、发生在邻近激酶活性位点的苏氨酸残基发生磷酸化。二、磷酸化与去磷酸化是控制Cdk活性的开关步骤磷酸化使T环变平，移向cyclinA，使Cdk和cyclin的相互作用更加稳定。Thr160的磷酸化使T环能够有效地与含有SPXK保守序列的蛋白底物作用。二、磷酸化与去磷酸化是控制Cdk活性的开关步骤(2)Cdk的抑制磷酸化由于Cdks的活化性磷酸化不受去磷酸化的调控，两种抑制磷酸化就在调节Cdk活性中起着重要作用：一个是保守的酪氨酸残基（人Cdks的Tyr15），这存在于所有的Cdks中。附近的苏氨酸残基（Thr14）的磷酸化进一步阻碍了Cdk的活化。Thr14和Tyr15位于激酶的ATP结合位点的顶端，它们的磷酸化可能通过干扰ATP磷酸根的方向而抑制Cdk活性。这些抑制性磷酸化位点的去磷酸化对cyclin-Cdks的激活至关重要，是开关样激活的关键开关位点。二、磷酸化与去磷酸化是控制Cdk活性的开关步骤蛋白激酶Wee1：负责Tyr15的磷酸化蛋白激酶Myt1：催化Thr14和Tyr15的磷酸化抑制性位点的去磷酸化由Cdc25家族的磷酸酶来执行。例一：G2/MCdk1开关样的激活抑制性位点的去磷酸化由Cdc25磷酸酶家族执行，Cdc25家族在脊椎动物中有三个成员（Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C）。例一：G2/MCdk1开关样的激活两种酶都受到它们有丝分裂底物M期cyclin-Cdk复合物的调节：由M-Cdk导致的磷酸化抑制Wee1而激活Cdc25。因此，在有丝分裂开始阶段，M-Cdk激活了它自身的激活因子，抑制了自身的抑制因子，形成了正反馈环来产生开关样的Cdk激活。尽管CKI的蛋白氨基酸序列的相似性很小，它们却拥有一些共同的重要功能特性。第一，CKI主要是S-和M-Cdk复合物的重要抑制因子，在细胞中高水平表达以确保在G1期中不存在任何S-或M-Cdk活性。第二，CKI不能抑制G1/S-Cdks，因此，它们不能阻断这些激酶在起始检查点的激活。最后，这些抑制因子最后要被Cdks磷酸化后降解。在G1期的晚期，上升的G1/S-Cdk活性能降解这些抑制因子——以允许S-Cdk在S期开始阶段被激活。三、CKI对G1期Cdk活性的抑制动物细胞的CKIs可分类为两大结构家族，对Cdk的抑制的机制不同。Cip/Kip家族成员：包括Dacapo和p27，结合周期蛋白和Cdk复合物。他们的基本功能是通过抑制G1/S-和S-Cdks来阻断细胞周期进程，但他们也能通过激活G1-Cdks来促进细胞周期的进入，INK4家族成员：是绝对的抑制因子，它们能特异性地针对Cdk4和Cdk6的单体，通过减少细胞周期蛋白的结合亲和力来起作用。三、CKI对G1期Cdk活性的抑制

Cip/Kip蛋白与周期蛋白-Cdk复合物的两个亚单位都结合p27的细胞周期蛋白结合部分与周期蛋白A的疏水斑作用。p27的Cdk结合区域与激酶亚单位广泛地相互作用。这些相互作用完全扭曲和部分拆散了在激酶活性位点上方的氨基端突出结构，也直接阻碍了ATP的结合位点，完全破坏了酶的催化功能。三、CKI对G1期Cdk活性的抑制

Cip/Kip蛋白还有助于激活G1激酶Cdk4和Cdk6周期蛋白D和Cdk4或Cdk6在没有其他蛋白的情况下结合并不紧密。Cip/Kip蛋白能通过与这两个亚单位作用而增强它们之间的结合。三、CKI对G1期Cdk活性的抑制INK4家族仅仅只是Cdk4和6的抑制因子，优先结合于Cdk单体这些抑制因子能在细胞周期蛋白结合位点的相反一侧结合Cdk的两个突出，破坏了ATP的结合与定向。INK4蛋白也将激酶上部的突出扭曲，使之不适合与细胞周期蛋白的结合三、CKI对G1期Cdk活性的抑制远祖真核细胞的细胞周期可能只由一个cyclin-Cdk振荡器操纵，但现代的真核生物拥有多个不同的cyclin-Cdk复合物，它们以固定的顺序被激活和失活。这种顺序的形成取决于不同cyclin的基因转录在不同细胞周期阶段顺序激活。芽殖酵母大约800个基因或裂殖酵母蛋白编码基因的约15%，在细胞周期中显示出明显的表达变化四、cyclin的水平震荡由基因表达调控在G1期的晚期通过起始点时表达，约300个成员。包括G1/S细胞周期蛋白、S期细胞周期蛋白，以及编码染色体复制和其他S期事件所必需酶的基因。G2/M期转换和有丝分裂时表达，约120种，包括了编码M期细胞周期蛋白的基因。有丝分裂后半段和G1期表达，大约含110种基因，包括编码Cdk抑制因子的基因。四、cyclin的水平震荡由基因表达调控G1是细胞周期中承前启后的重要时期，一方面细胞要清除上一个周期的各类调节因子的残存，为下一次DNA复制做好准备；另一方面，为了维持细胞体积的恒定，细胞生长的调节机制必须让细胞在这个时期大量合成细胞内容物，争取在下次分裂前细胞的体积能够加倍。当增大细胞的体积到一定的阈值时，就传递某种信号给细胞周期调控系统，不可逆地启动下一个新细胞周期的进程。例2：G1期Cdk的活性调控方式G1期Cdk活性的抑制机制。增加细胞周期蛋白的降解Cdk抑制蛋白对Cdk活性的抑制作用减少细胞周期蛋白基因表达例2：G1期Cdk的活性调控方式动物细胞Start检验点之前，G1/S基因的表达被抑制型E2F的结合而抑制。所以Start检验点G1/S基因表达的升高依赖于抑制型E2F从G1/S基因的启动子上去除，并被置换成激活型的E2Fs。这个过程依赖于pRB蛋白质的失活。例2：G1期Cdk的活性调控方式：基因表达细胞跨过Start检验点，激发G1/S基因表达的关键是pRB的磷酸化。pRB蛋白是细胞周期的主要刹车机制，通过结合转录因子E2F，抑制了E2F的转录激活功能。例2：G1期Cdk的活性调控方式：基因表达周期蛋白D-Cdk复合物只催化了部分pRB的磷酸化和E2F的激活。E2F的完全激活只有在G1期的末段G1/S-Cdk：周期蛋白E-Cdk2的活性升高并完成pRB蛋白的磷酸化作用后。正反馈例2：G1期Cdk的活性调控方式：基因表达一个细胞周期事件向下一个细胞周期的转换是单向的并且是不可逆的，这个不可逆性可以通过Cdk激活的不可逆性来部分实现，更重要的保证是cyclin的降解。有丝分裂cyclin降解保证了有丝分裂的退出，也使Cdk活性在G1期维持低的状态。周期蛋白，CKI和其他细胞周期调控因子通过泛素化途径被定向降解。泛素化经过一系列反应中完成—泛素激活，泛素偶联和泛素—蛋白连接作用，泛素化的蛋白质最后被称为蛋白酶体（proteasome）的巨大蛋白酶复合体识别并降解。五、蛋白质降解控制了细胞周期的单向性泛素活化酶（E1）：将泛素转移到一个泛素结合酶家族成员（E2）上。E2与靶向特异性泛素连接的酶（E3）合作，催化泛素活化的甘氨酸羧基端与靶蛋白的赖氨酸侧链形成肽键。被26S蛋白酶体识别，降解泛素化蛋白成短肽。泛素-蛋白连接酶通常在泛素化机制中是最重要的调节靶蛋白，一方面是因为它们在泛素化过程中是靶蛋白特异性的主要决定因素，另一方面是因为它们是催化该过程的限速步骤。G1/S转换:关键的泛素-蛋白连接酶是称为SCF的一种酶，它的命名来源于其三个中心成分——Skp1,cullin和F-盒。中后期转换:关键的泛素-蛋白连接酶为后期促进因子（APC）或cyclosome。5.蛋白质降解控制了细胞周期的单向性有丝分裂后半段事件主要受到两种机制的调控：APC介导的蛋白质降解作用和Cdk1磷酸化底物的去磷酸化作用。APC控制了细胞周期调控检查点的启动：中期—后期转换检查点。当细胞进入中期时，姐妹染色单体的分离被强大的抑制系统阻止。而当姐妹染色单体一旦完成双指向整列，这些“刹车系统”就被泛素蛋白连接酶APCCdc20酶解去除。APCCdc20将蛋白质泛素化修饰，使之被定向酶解，进而发动不可逆转的后期进程，并退出有丝分裂。例3，APC控制的蛋白降解：中/后期转化当细胞到达中期时，M-Cdks通过磷酸化APC核心亚单位激活了APC，这增强了与Cdc20的结合。然后APCcdc20靶向降解安全子和M期细胞周期蛋白，从而灭活M-Cdks。因此，M-Cdks触发了导致自身最终降解的系列事件，形成一个负反馈环。例3，APC控制的蛋白降解：中/后期转化APCCdc20触发了两个关键调控蛋白的泛素化和酶解：第一，securin的酶解释放出蛋白酶分离酶（separase），切割黏连蛋白的Scc1亚基，打破姐妹染色单体之间的黏合；第二，有丝分裂cyclin的酶解导致很多Cdk靶蛋白的去磷酸化，这为有丝分裂后半段事件的发生所必需。例3，APC控制的蛋白降解：中/后期转化例3，APC控制的蛋白降解：中/后期转化

不同的激活因子决定APC的底物特异性APC的激活因子有两种：Cdc20和Cdh1。有丝分裂的前半段和后半段的开始时，Cdh1被Cdk磷酸化，与APC的结合被抑制。此时APC结合Cdc20，其底物主要为S，M期cyclin和securin。有丝分裂中期Cdk的失活使APC与Cdh1去磷酸化，从而导致APC与Cdc20结合下降而与Cdh1亲和力增加，形成的APCCdh1的其中一个靶蛋白又是Cdc20，这样就彻底关闭APCCdc20的功能。同时APCCdh1决定了其他不被APCCdc20识别蛋白质的酶解，如有丝分裂蛋白激酶Plk和AuroraA。所以Plk和AuroraA的降解的时间要晚于cyclinB-Cdk1，这对有丝分裂的退出至关重要。例3，APC控制的蛋白降解：中/后期转化2．抑制因子决定了APC激活的时间一个叫Emi1的蛋白质在G2期和有丝分裂的前半段与Cdc20结合，并可能阻碍其与APC的相互作用而抑制了APC的活化。在前期的末段，Emi1可以同时被Plk和cyclinB-Cdk1复合物磷酸化，为泛素蛋白连接酶SCFb-TrCP1所识别，导致Emi1在前中期被酶解，释放出Cdc20，形成有活性的APCCdc20。Emi1水平在G1期结束时再次升高，抑制了APCCdh1的活性。例3，APC控制的蛋白降解：中/后期