第五章 分子水平上的基因功能

第五章分子水平上的基因功能问题：1.基因究竟是何种物质？这种物质有哪些重要的理化性质？2.基因在分子结构上有哪些显著特点？3.基因的信息是怎样传递和表达的？其功能又是如何实现的？4.成千上万的基因的表达是如何得到精确调控的？……第五章分子水平上的基因功能第一节遗传物质的研究第二节DNA的基本性质第三节基因的分子结构第四节DNA与蛋白质第五节基因的功能第六节基因的精细结构第七节基因的表达调控第一节遗传物质的研究遗传物质必须具备的几个条件：(1)自我复制，代代相传(2)储备、传递信息的潜在能力(3)稳定性强，变异罕见(4)细胞分裂时能将遗传信息有规律分配到子细胞中DNA是遗传物质的间接证据：1.DNA含量的恒定性2.配子的DNA含量正好是体细胞的一半3.基因突变与紫外线诱变波长的关系体内转化实验－DNA是遗传物质的直接证明（1）1928年英国微生物学家F.Griffith做了肺炎双球菌的转化实验1944年O.Avery等揭开了转化因子的化学本质体外转化实验－DNA是遗传物质的证明（2）体外转化实验要点：将S细胞提取液纯化的DNA加到R细胞培养物中就能产生R---S的转化这种转化因子对水解DNA的酶敏感R型细菌转化为S型后，按同样方法抽提DNA仍有转化能力转化的细菌与S型细菌相比，荚膜生化特性完全一样

1952年Hershey和Chase的同位素标记侵染实验噬菌体的侵染标记实验－DNA是遗传物质的证明（3）Tobaccomosaicvirus,TMV5%RNA,95%Protein1956年，Gierer和Schraim分离RNA和protein的实验烟草花叶病毒的感染和繁殖过程

－RNA也是重要的遗传物质TMV病毒重建实验1957年Fraenkel-Conrat和Singer的病毒重建实验第二节DNA的基本性质一、DNA的一级结构二、DNA的二级结构三、DNA的复制一、DNA的一级结构(一)“四核苷酸”假说P.A.T.Levene(1930)提出“四核苷酸”假说，认为：核苷酸是核酸的基本组成单位核酸是“磷酸—核糖(碱基)—磷酸”的核苷多聚体四核苷酸假说奠定了核酸化学基础，但同时认为：核酸多聚体是由“四核苷酸结构”重复形成每个四核苷酸结构包含四种碱基各一个所以认为在任何DNA中，四种碱基是等量的，DNA是四核苷酸结构的简单重复这种观念影响了人们对核酸生物学功能的进一步认识(二)查伽夫定则及其意义E.Chargaff于1946-1950年根据纸层析、离子交换层析和紫外分光光度试验结果提出查伽夫定则：四种碱基的数量不是等量的；同一物种DNA碱基组成不变，而物种间则有很大不同；嘌呤碱基总量与嘧啶碱基的总量(克分子总量)相等(A+G=T+C)，且A=T、G=C。*(三)核苷酸序列及其测定查伽夫定则表明：核酸并不是四核苷酸结构的简单重复，核酸的碱基序列信息可能具有重要意义以后的研究表明：碱基序列正是核酸生物学功能的基础，是遗传信息的内在形式DNA及RNA分子序列分析技术也是最重要的分子遗传学研究技术：Sanger双脱氧法Maxam&Gillbert化学法二、DNA的二级结构*(一)、DNA分子结构的研究1.鲍林研究小组2.威尔金斯、富兰克林研究小组3.沃生、克里克研究小组

(二)、DNA分子双螺旋结构模型1.DNA分子双螺旋结构模型要点2.DNA双螺旋结构模型的意义3.DNA分子构型的多态性4.DNA分子杂交*(一)、DNA分子结构的研究在“四核苷酸”假说的误导下，人们普遍认为核酸的组成、结构简单，可能不具有重要功能，一度忽略了对核酸的研究上世纪中期，众多研究表明：核酸是遗传信息的载体，显然DNA的结构研究是进一步研究其功能和作用方式的基础也由此激发了科学家从事核酸结构研究的兴趣，当时进行DNA结构研究的科学家很多1.鲍林研究小组主要工作：鲍林(Pauling)等1951年(提出蛋白质α-螺旋模型后)开始研究DNA分子结构根据阿斯伯利Astbury等1938年获得的DNA分子晶体X射线衍射图像(显示DNA分子晶体呈螺旋结构)进行研究提出DNA分子三链螺旋结构模型：引入多链、螺旋和氢链等概念评价：虽然他们提出的模型并不正确，但是其研究方向和所采用的方法却为DNA分子结构模型研究确立了方向注：1954年鲍林因研究物质聚合力而获得诺贝尔化学奖2.威尔金斯、富兰克林研究小组主要工作成就：Wilkins和Franklin改进了DNA分子晶体X射线衍射图谱技术于1951年获得了更为清晰的图像结果表明：

碱基位于螺旋内侧而磷酸基团在外侧，同时测得了DNA螺旋的直径和螺距3.沃生、克里克研究小组主要基于Chargaff、Pauling和Wilkins等三个方研究成果，Waston和Crick于1953年提出了他们的DNA双螺旋结构模型。现在人们公认这是分子遗传学建立的标志。为此Waston，Crick和Wilkins于1962年获得了诺贝尔生理学及医学奖。(二)、Watson&Crick的DNA双螺旋结构1.DNA分子双螺旋结构模型要点2.DNA双螺旋结构模型的意义DNA双螺旋模型结构同时表明：DNA复制的明显方式——半保留复制。Waston和Crick在1953年就指出：DNA可以按碱基互补配对原则进行半保留复制。而在此之前对复制方式人们一无所知基因和多肽成线性对应的一个可能的理由：DNA核苷酸顺序规定该基因编码蛋白质的氨基酸顺序；DNA中的遗传信息就是碱基序列；并存在某种遗传密码(geneticcode)，将核苷酸序列译成蛋白质氨基酸顺序在其后的几十年中，科学家们沿着这两条途径前进，探明了DNA复制、遗传信息表达与中心法则等内容。3.DNA分子构型的多态性4.DNA分子杂交分子杂交是指用一个DNA单链与另一被测DNA单链或RNA单链杂交形成双链，以测定某特异顺序是否存在的方法DNA变性（denaturation）、复性（renaturation）或退火（annealing）Southern杂交（DNA/DNA杂交）Northern杂交（DNA/RNA杂交）三、DNA的复制半保留复制DNA复制的起点DNA复制的方向DNA的酶促合成链的延伸（半不连续）半保留复制DNA复制的起点与方向E.Coli中DNA从单个复制起点开始双向复制高等生物的DNA复制是从多个复制起点开始双向进行的DNA的酶促合成E.Coli：DNA聚合酶Ⅰ——DNA的损伤修复

DNA聚合酶Ⅱ——不清楚

DNA聚合酶Ⅲ——DNA复制真核生物：α、β、γ和δα负责DNA的复制

β在损伤修复中起作用DNA酶促合成的特点:

要求dNTP,Mg2+等需要DNA模板需要引物DNA的不连续复制第三节基因的分子结构外显子和内含子(exon&intron)侧翼序列和调控序列

启动子(promoter)

增强子和沉默子(enhancer&silencer)

终止子(terminator)

绝缘子(insulator)原核基因结构示意图真核基因结构示意图GT-AG法则，是RNA剪接的信号1.启动子(promoter)：转录的起始和链的选择信号的DNA核苷酸顺序，是RNA聚合酶的结合起点整个启动子应包括-10和-35两个区域原核侧翼序列与调控序列说明：这两个区域的顺序来自于E.coli,它并不代表所有原核生物定点突变的结果表明，启动子的作用是整个区域而不是单个核苷酸，但单个核苷酸的突变会导致转录水平的上升或下降，特别是A/T突变为G/C下降更明显启动子的功能：是RNA聚合酶结合的位点，决定转录的起始位点及链的选择。-10区是核心酶结合的位点，-35区是σ因子结合的位点。2.起录点、SD顺序及起译点起录点：指转录的起始点。这一位点位于启动子-10区的下游10bp处，原核生物基因起录点附近的三个核苷酸，大多数基因是CAT，所以在原核生物中也常用CAT表示起录点。但并不是绝对的，有时会有变化，如CAC，TAC等。一般来说，起录点可用PyA/gPu表示（A/g表示大多数情况下是Ａ，少数情况下是Ｇ）。转录就是从A/g位点开始。

翻译识别点（SD顺序）：是核糖体识别并与mRNA结合的位点。在每个基因起始点的下游都有一小段富含嘌呤的顺序5’AGGAGG3’。这一顺序可与核糖体30S亚基上的16SrRNA的3’末端富含嘧啶的顺序5’CCUCCU3’互补，这一顺序就称为SD顺序。典型的SD顺序是AGGAGG，但事实上在这6bp中，只要有连续的3个bp以上与CCUCCU互补，便可作为核糖体的识别顺序，但是SD的长度会直接影响mRNA与核糖体结合的紧密度，从而影响翻译效率。

SD顺序位于起录点下游，起译点上游，距起译点5~16bp，而与CAT的距离变化较大。起译点：翻译的起始位点。在原核生物中一般是ATG，极少数是GTG，编码甲酰甲硫氨酸。

3.终止子一个基因或操纵子的3’末端往往有一段特定的，有终止转录作用的顺序，这段顺序称为转录终止子，简称终止子（terminator）。终止子的结构：一小段反向重复序列（回文序列），从而使转录出的RNA具有特定的茎环结构。这一结构对终止转录起着决定性作用与启动子不同，真正起终止作用的不是DNA序列本身，而是转录生成的RNA

终止子类型：根据终止作用是否需要辅助因子，把终止子分为不依赖ρ蛋白的终止子（即强终止子）和依赖于ρ的终止子（弱终止子）。

强终止子与弱终止子在结构上的区别在于强终止子在回文区内富含G/C对而回文区的下游区有6~8对A/T对。相反，弱终止子在回文区内G/C对含量较少，下游区A/T对含量较少。

根据终止子所处的位置，可以把终止子分为存在于基因末端的终止子和存在于基因内部的终止子（弱化子）。CATSDATGTGATer-35-10+1上游Leadersequence

转录区编码区

单顺反子转录单位CATSDATGTGAATGTGATerCRP-35-10+1上游Leadersequence转录区

编码区

编码区下游下游多顺反子转录单位4.小结真核生物有三种RNA聚合酶分别识别不同的启动子：

RNA聚合酶I位于核仁，负责转录rRNARNA聚合酶II位于核质，负责转录mRNARNA聚合酶III位于核质，转录tRNA及5SrRNA这里主要介绍RNA聚合酶II负责转录的基因，这些基因也称II类真核基因真核基因转录的启动与终止１）TATA框（TATAbox）

位于转录起始位点上游-19~-27bp处有一段高度保守顺序：

ATTATAATA

在这段顺序中，头三个和倒数第二个核苷酸是高保守的。TATA顺序除了可启动转录外，它的位置的准确性有保证转录起始从精确位置上开始的作用。

1、真核生物的启动子的主要组件2）CAAT框（CAATbox）

CAAT顺序位于-70~-80处，比较保守的一致顺序是：

GGCCAATCT3）GC框（GCbox）也称远端因子（distalelement），位于-80~-100bp处，其基本顺序是：

GGGCGG

说明：上述三段顺序并不是存在于所有真核生物的所有基因，其中TATAbox分布较广，位于几乎所有RNApolⅡ转录的基因的前端。三段顺序都不是绝对不变的，不同的基因其顺序可能相差较大。人工定点突变说明，这三段序列的任何一个单核苷酸突变都将使基因的转录水平改变（上升或下降），但并不使转录完全停止，说明起作用的功能单位并不是单个核苷酸。

真核生物基因的转录除了与启动子有关外，还与一段称为增强子的顺序有关。1）核心顺序：增强子的长度相差较大，可达几十到几百个核苷酸，其顺序变化也比较大，但都含有一段较相近的核心顺序（coresequence）：

GTGGGAAATTT2.增强子（enhancer）2）作用：使转录能力大大提高，可达几百至上千倍3）作用特点（与启动子相比的不同点）：作用没有方向性，不论位于基因上游、下游或基因内部，不论是3’→5’或5’→3’方向，都可发挥正常作用无物种和基因的特异性有组织特异性作用范围较广，有几个Kb范围内有效顺式作用1）起录点：原核生物的起录点常是CAT，但在真核生物中变化较大，并不统一。但是刚开始转录的第一个核苷酸也经常是A，少数是G。由于真核生物的起录点是转录后mRNA加工时的加帽位点，所以这一位点又称为Cappingsite简称Cap。2）核糖体结合的顺序：真核生物的核糖体结合顺序与原核生物的SD顺序（AGGAGG）明显不同。在真核生物中核糖体结合顺序是一段富含嘧啶的TCCTTCC，这一顺序是mRNA与核糖体中18SrRNA结合的位置。3.起录点、核糖体结合顺序与起译点3）起译点：真核生物的起译点与原核生物相同，也是ATG，极少数是GTG，但不论ATG或GTG，结合的都是Met。4.真核生物的终止子真核生物终止子研究得不多，还不很清楚，但已在组蛋白基因、SV40基因中发现类似于原核生物的终止子。EnhancerTATAAATAAATerCAATCapEx.In.Ex.AUGUGA远上游区

近上游区

转录区

编码区

编码区5.小结第四节遗传信息的表达一、中心法则及其发展二、遗传信息的转录(RNA的合成)

与RNA的加工三、遗传密码及其特性四、遗传信息的翻译一、中心法则及其发展中心法则(centraldogma)阐述生物世代、个体以及从遗传物质到性状的遗传信息流向，即遗传信息在遗传物质复制、性状表现过程中的信息流向。最初由Crick提出，并经过了多次修正。中心法则的发展反转录(逆转录)：反转录酶；cDNA。RNA的自我复制DNA指导蛋白质合成二、遗传信息的转录（一）RNA合成的基本特点1960年S.B.Weiss等发现RNA聚合酶其特点是：（1）以核糖核苷三磷酸（rNTR）为底物（2）以DNA为模板（3）按5’~3’方向合成（4）无需引物的存在能单独起始链的合成（5）第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在（6）在体内DNA双链中仅一条链作为模板（7）RNA的序列和模板是互补的转录（transcription）以DNA为模板在RNA聚合酶的作用下合成RNA的过程称为转录。转录是一个不对称过程，RNA合成时仅以DNA双链中的一条作为模板将作为转录模板的DNA单链称为模板链或反义链（antisenstrand），非模板链称为有义链（sensestrand）或编码链。RNA合成和DNA复制的区别（1）转录时只有一条DNA链为模板，而复制时两条链都可作为模板（2）DNA-RNA杂合双链不稳定，RNA合成后释放，而DNA复制叉形成后一直打开，新链和母链形成子链（3）RNA合成不需引物，而DNA复制需引物（4)转录的底物是rNTP，复制的底物是dNTP（5）聚合酶系不同真核生物的转录真核生物的转录和原核转录的不同点：(1)原核只有一种RNA聚合酶，而真核细胞有三种聚合酶

(2)启动子的结构特点不同，真核有三种不同的启动子和有关的元件

(3)真核的转录有很多蛋白质因子的介入三、遗传密码及其特性遗传密码的基本特性：三联性非重叠性连续性简并性有序性通用性起始密码子与终止密码子：起始密码子：

AUG(甲硫氨酸/甲酰甲硫氨酸)；终止密码子(无义密码子)：

UAA(赭石)、UAG(琥珀)、UGA(乳白)。通用性的另外情况：第五节基因的功能(一)现代基因概念(二)基因的功能类型(三)基因的几种特殊形式(四)基因功能的认识过程现代分子遗传学关于基因的概念(一)现代基因概念基因是DNA分子上带有遗传信息的特定核苷酸序列区段。基因由重组子、突变子序列构成的。重组子是DNA重组的最小可交换单位；突变子是产生突变的最小单位；重组子和突变子都是一个核苷酸对或碱基对(bp)。基因可以包含多个功能单位(顺反子)。(二)基因的功能类型根据基因的原初功能可以将基因分为：1.编码蛋白质的基因，即有翻译产物的基因。如结构蛋白、酶等结构基因和产生调节蛋白的调节基因。2.没有翻译产物，不产生蛋白质的基因。转录产物RNA不翻译，如编码tRNA、rRNA。3.不转录的DNA区段。如启动子、操纵基因。启动子是转录时RNA多聚酶与DNA结合的部位。操纵基因是阻遏蛋白、激活蛋白与DNA结合的部位。(三)基因的几种特殊形式1.重复基因：指在染色体组上存在多份拷贝的基因。重复基因往往是生命活动中最基本、最重要的功能相关的基因。最典型的重复基因是rRNA、tRNA和组蛋白基因等。2.重叠基因：同一段DNA序列，由于阅读框架或转录范围的不同，而同时成为两个或两个以上基因的组成部分基因在染色体上可能有重叠，甚至一个基因完全存在于另一个基因内部。3.断裂基因或隔裂基因生物遗传和早期分子遗传认为基因是一个连续的、完整的结构。1977年Doel研究表明：卵清蛋白基因中间存在不表达的碱基序列，表明基因的DNA序列可能是不连续的。外显子：参加蛋白质编码的DNA片段内含子：不参加蛋白质编码的DNA片段真核生物基因可能是不同外显子的组合——断裂基因4.跳跃基因(jumpinggene)又称为转座子(transposon)、转座因子、转位因子(transposableelement)。生化遗传和早期分子遗传学还认为基因在染色体上的相对位置是固定的后来发现某些DNA序列可以在染色体上转变位置转座子转位的过程也是一个遗传重组过程转座子在染色体上转位可能会引起插入位置基因功能丧失(突变)，再次转位离开插入点时便会发生基因功能的恢复尿黑酸氧化酶苯丙基氨酸酪氨酸尿黑酸HydrolysisofdietaryproteinsCH2CHCOOHNH2CH2CHCOOHNH2HOCH2COOHHOOHCH3CCH2COOH+HOOCHC=CHCOOH

OCO2+H20正常代谢途径

黑尿症非

研究人类的先天性代谢疾病，其中有一种是尿黑酸症

Garrod(1902):一个突变基因---一种代谢缺陷

OneMutantGene---OneMetabolicBlockS.A.Garrod（四）基因功能的认识过程

一基因一酶学说

1941Beadle&Tatum提出：“onegeneoneenzyme”hypothesis

乙酰鸟鸟氨酸精精氨琥珀精氨琥珀氨酸酶氨甲酰酶酸合成酶酸裂解酶↓↓↓↓

N-乙酰鸟氨酸瓜氨酸精氨精氨酸鸟氨酸琥珀酸氨甲酰磷酸天冬氨酸图4精氨酸生物合成途径

BeadleandTatum:一个基因---一种酶

OneGene---OneEnzymeXraysMMCMMMVitaminsAminoacids

Purinesandpyrimidines

用X射线诱导处理脉孢霉，筛选出被诱导的突变体来进行实验。根据遗传分析和大量研究，他们认为基因发生突变，就可能导致酶活性的丧失

脉孢霉实验突变品系基本基本培养基加培养基鸟氨酸瓜氨酸精氨酸

argH－－－＋

argF－－＋＋

argE－＋＋＋abcdABCD12345ABCDEG突1－－－＋－＋变2－＋－＋－＋体3－－－－－＋4－＋＋＋－＋5＋＋＋＋－＋OneGene，OneEnzyme54213EACBDGOneGene,OneProtein

OneGene,OnePolypeptideChain镰刀形细胞贫血症。正常HbA四条多肽链（2条链，两条链）VernonM.Ingram证明链第六位氨基酸在HbA中是谷氨酸，在HbS中是缬氨酸。证明基因与氨基酸之间存在直接对应关系的第一个直接证据第六节基因的微细结构与性质（一）位置效应（二）双重感染与基因内重组、遗传的最小结构单位（三）遗传的最小功能单位（一）位置效应位置效应：基因在染色体上位置不同对性状表现的作用(程度)也可能不同。果蝇16A区段(Bar基因)重复处于染色体的不同位置对其个体眼面大小(小眼数目)的效应不同。位置效应表明：染色体并非基因的简单容纳器，基因在染色体上的位置也对其功能具有重要影响。所以“念珠理论”的第一点(基因与染色体的关系)得到了发展。“念珠理论”的另一个内容是基因的结构不可分性(最小遗传结构单位)。不可分性最早遇到的挫折也是来自对果蝇的研究。（二）基因内重组的发现C.P.Oliver于1940年首次报道果蝇X染色体上lozenge位点上两个等位基因lzs和lzg，杂种雌性（lzs/lzg

）表型为突变型。用此雌蝇与lzsY或lzgY雄蝇交配，产生0.2%的野生表型后代用侧翼标记证明lzs和lzg是位于lozenge位点的不同位置，lz+染色体的产生是由于在这两个点之间发生了交换基因是可分的，基因内含有突变和可被重组分离的位点（二）T4突变型(rII)遗传研究SeymourBenzer(1955)对E.coli烈性噬菌体T4突变型的遗传研究T4野生型在E.coli菌苔上产生小而不规则噬菌斑。T4突变品系按表型可分为：rI、rII、rIII三类。其中rII在E.coliB上产生快速溶菌现象，形成大而圆噬菌斑，在E.coliK(λ)上不能生长。试验方法与结果试验方法：最初得到8个不同的rⅡ突变型品系，8个突变基因均定位于T4DNA的一个区段内(rII区段)；将8种突变型两两组合混和感染E.ColiB菌株(双重感染,doubleinfection或称重组测验)；从混和培养物中提取噬菌体颗粒感染E.coliK(λ)。试验结果：在菌苔上获得了许多小而粗糙的野生型噬菌斑。双重感染试验野生型的产生与基因内重组结果分析：回复突变的频率很小，不会产生如此高频率的野生型噬菌体(斑)；所以野生型只能由重组产生。用拟等位基因可以解释试验结果；但同时意味着：rII区段内至少存在8个拟等位基因。Benzer先后分离到400多个不同的rII突变。在rII区段内存在如此多的基因显然是不可能的。结论：这些基因并不是所谓的拟等位基因，而就是rII区段突变形成的复等位基因。基因是由更小的重组单位构成，野生型产生于基因内重组，从而推翻了经典遗传学基因不可分性的性质。*双重感染法绘制rII区段连锁图操作方法：用两种rII突变型双重感染B品系，收集溶菌液分别接种到B品系、K(λ)品系菌苔上考察两个品系菌苔上的噬菌斑数目，就可以计算两个突变位点间的重组值绘制连锁遗传图由于采用了条件致死选择系统(即在E.ColiK(λ)上rII不能生长)，分辨率极高，可以检测到十万分之一的重组值基因的最小结构单位重组值检测精度可达十万分之一，但实际结果不会低于0.01%；可推断基因内存在最小重组单位，Benzer将最小重组单位定义为重组子(recon)。rII区段存在多种突变的结构表明：基因也并非最小突变单位。Benzer提出用突变子(muton)来描述基因突变的最小单位。理论上讲突变子不必等于重组子。但以后研究显示：突变子和重组子都是一个核苷酸对或者碱基对(bp)。所以基因内每个碱基均可能发生突变，任意两个碱基间均能发生交换重组。基因的精细结构和顺反测验双突变杂合体的互补作用假定有两个独立起源的隐性突变，具有类似的表型，如何判定是属于同一基因(功能单位)的突变还是分别属于两个基因(功能单位)的突变呢？在二倍体生物中，可以建立双突变杂合体。双突变体杂合体有两种形式，即顺式(cis)和反式(trans)，如图所示：顺反测验与顺反子根据两突变反式双杂合体有