第7章原核基因表达调控

1第7章原核基因表达调控教学目的：

1.掌握原核基因表达调控的相关概念。

2.掌握乳糖操纵子的结构及调控机理。

3.掌握色氨酸操纵子的结构及调控机理。

4.了解原核基因转录后的不同调控方式。教学重点：乳糖操纵子和色氨酸操纵子的调控模型。2第7章原核基因表达调控

7.1原核基因表达调控总论

7.2乳糖操纵子与负控诱导系统

7.3色氨酸操纵子与负控阻遏系统

7.4其他操纵子

7.5固氮基因调控

7.6转录水平上的其他调控方式

7.7转录后调控37.1原核基因表达调控总论所有细胞都有一套准确调节基因表达和蛋白质合成的机制。自然选择倾向保留高效率的生命过程。从DNA到蛋白质的过程称为基因表达，基因表达的实质就是遗传信息的转录和翻译。对基因表达过程的调节称为基因表达调控。基因表达调控主要表现在：转录水平上的调控和转录后水平上的调控。原核生物的营养状态和所处的环境条件对其基因表达具有重要的影响。原核细胞的转录和翻译同时同地发生。47.1.1原核基因表达调控分类原核基因表达调控主要发生在转录水平上。根据调控机制分为：负转录调控和正转录调控。原核生物以负调控为主。在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白，起阻止结构基因转录的作用。负转录调控又可分为负控诱导和负控阻遏。在负控诱导系统中，阻遏蛋白不与效应物(诱导物)结合时，结构基因不转录。在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物(诱导物)结合时，结构基因转录。阻遏蛋白作用的部位是操纵区(操纵基因O)。5在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白。激活蛋白存在时被控制的基因得到表达。正转录调控可分为正控诱导和正控阻遏。在正控诱导系统中，效应物(诱导物)的存在使激活蛋白处于活性状态。在正控阻遏系统中，效应物的存在使激活蛋白处于非活性状态。转录水平上的基因表达调控取决于DNA结构、RNA聚合酶功能、蛋白因子等成分的相互作用。大肠杆菌中参与基因表达调控的蛋白因子是σ因子(见P250表7-2)。677.1.2原核基因表达调控的特点可诱导调节一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭状态转变为开启状态。即在某些物质的诱导下使基因活化。如大肠杆菌的乳糖操纵子属于诱导型操纵子。诱导型操纵子主要调控分解代谢途径。可阻遏调节这类基因平时是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏基因的表达。如大肠杆菌色氨酸操纵子属于阻遏型操纵子。阻遏型操纵子主要调控合成代谢途径。87.1.3弱化子对基因活性的影响弱化子(衰减子)是一段位于结构基因上游前导区具有终止子结构的短序列，通过前导序列转录产生的mRNA形成类似于终止子的二级结构，达到转录终止的目的。弱化子是在研究大肠杆菌的色氨酸操纵子表达弱化现象中发现的。在这种调节方式中，起信号作用的是有特殊负载的氨酰-tRNA的浓度，在色氨酸操纵子中就是色氨酰-tRNA的浓度。原核生物利用弱化调控系统建立细致而精细调控机制，以增强对环境的适应性。97.1.4降解物对基因活性的调节操纵子学说的核心是使基因从表达抑制状态中解脱出来，是从负调节的角度来考虑基因表达调控的。降解物抑制作用的调节能使基因由低水平表达变成高水平表达。有葡萄糖时，即使有他的糖，与其相对应的操纵子也不会启动，不会产生出代谢这些糖的酶来，这种现象称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用。葡萄糖能抑制腺苷酸环化酶活性，使环腺苷酸受体蛋白(CRP)不能与cAMP形成复合物。降解物抑制作用是通过提高转录强度来调节基因表达的，是一种积极的调节方式。107.1.5细菌的应急反应细菌在正常情况下，如果环境中缺少某种能源时能找到其他代用物，进行正常的基因表达调节。当细碰到菌氨基酸全面匮乏的紧急状况时，将会产生应急反应，使生产各种RNA、糖、脂肪和蛋白质等几乎全部的生化反应过程均被停止。实施这一应急反应的信号是ppGpp和pppGpp。产生这两种物质的诱导物是空载tRNA。空载tRNA会激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大量合成。ppGpp会关闭许多基因，也会打开一些合成氨基酸的基因，以应付这种紧急状况。ppGpp与pppGpp的作用范围广是超级调控因子。117.2乳糖操纵子与负控诱导系统1961年，Monod和Jacob提出了操纵子学说，此后不断完善，1965获年诺贝尔生理学和医学奖。操纵子是基因表达的协调单位，由启动基因(P)、操纵基因(O)及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。操纵基因受调节基因(I)产物的控制。127.2.1酶的诱导——lac体系受调控的证据在不含乳糖及β-半乳糖苷的培养基中，lac+基因型大肠杆菌细胞内β-半乳糖苷酶和透过酶的浓度很低，每个细胞内大约只有1~2个酶分子。在培养基中加入乳糖后，酶浓度迅速提高，每个细胞中有超过105个酶分子。当有乳糖供应时，在无葡萄糖培养基中生长的lac+细菌中将同时合成β-半乳糖苷酶和透过酶。培养基中加入乳糖1~2min后，编码β-半乳糖苷酶和透过酶的lacmRNA量就迅速增加。去掉乳糖后，lacmRNA量立即下降到几乎无法检测到，表明乳糖确实能激发lacmRNA的合成。137.2.2操纵子模型及其影响因子1961年Jacob和Monod发表了lac操纵子负控诱导模式，建立乳糖操纵子的控制模型，主要内容如下：Z、Y、A基因的产物由同一条mRNA编码。该mRNA的启动区(P)位于阻遏基因(I)与操纵区(O)之间，不能单独起始Z和Y基因的高效表达。操纵区是DNA上的一小段序列(26bp)，是阻遏蛋白的结合位点。当阻遏蛋白与操纵区相结合时，lacmRNA的转录起始受到抑制。诱导物通过与阻遏蛋白结合，改变其三维构象而不能与操纵区相结合，从而激发lacmRNA的合成。141)Lac操纵子的本底水平表达诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要透过酶，透过酶的合成又需要诱导。有些诱导物不经过透过酶而进入细胞；有些透过酶不经诱导物的诱导而合成。乳糖并不直接与阻遏蛋白结合，真正与阻遏蛋白结合的是异构乳糖(葡萄糖-1,6-半乳糖)。异构乳糖是乳糖在β-半乳糖苷酶催化下形成的。乳糖诱导β-半乳糖苷酶的合成需要有β-半乳糖苷酶的预先存在。在非诱导状态下有少量的lacmRNA合成，每个细胞中约有1~5个mRNA分子，这种合成称为本底水平的组成型合成。152)大肠杆菌对乳糖的反应细菌生长在以甘油为碳源的培养基中，由于lac操纵子本底水平的表达，每个细胞内有几个分子的β-半乳糖苷酶和透过酶。加入乳糖后，在单个透过酶作用下，少量乳糖进入细胞，再由单个β-半乳糖苷酶转变成异构乳糖。某个异构乳糖与操纵区上的阻遏蛋白相结合并使其失活而离开操纵区，开始lacmRNA的合成。这些mRNA分子翻译出大量的β-半乳糖苷酶和乳糖透过酶，其结果将导致乳糖大量涌入细胞。16多数乳糖被降解成为葡萄糖和半乳糖。有部分乳糖被转变成异构乳糖而与阻遏蛋白结合。阻遏蛋白的失活促使mRNA高速合成，进一步提高透过酶和β-半乳糖苷酶的浓度。乳糖降解产生的葡萄糖被细胞用作碳源和能源，降解产生的半乳糖则被另一套酶体系转变成葡萄糖。如果细胞中所有的乳糖被消耗完，由于阻遏蛋白仍在不断地被合成，有活性的阻遏蛋白浓度将超过异构乳糖的浓度，使细胞重新建立起阻遏状态，导致lacmRNA合成被抑制。173)lacI基因产物及功能lac操纵子阻遏蛋白mRNA是由弱启动子控制下组成型合成的，每个细胞中有5~10个阻遏物分子。阻遏蛋白由4个相同的亚基组成，每个亚基含有347个氨基酸残基。每个亚基的N端为DNA结合结构域，中间为与诱导物相结合的两个相似的核心结构域，C端为α螺旋参与阻遏蛋白的聚合。单体间通过中间核心结构域相互作用形成二聚体，两个二聚体通过C端α螺旋聚合成四聚体。18无诱导物时，阻遏蛋白通过二聚体的两个HTH特异性地结合到lac操纵子的操纵基因(O)上，阻止RNA聚合酶与启动基因(P)结合，抑制lacmRNA的转录。当细胞中乳糖水平升高，异构乳糖的浓度增加时，异构乳糖能有效地结合到阻遏蛋白的核心结构域上，引起阻遏蛋白的构象改变。变构后的阻遏蛋白不再特异性地结合lac操纵基因(O)，而随机地与DNA任意区域相结合。此时lac操纵子的转录起始区暴露，被RNA聚合酶结合，激活lacmRNA的转录。乳糖耗尽后，阻遏蛋白重新与操纵基因(O)结合，终止转录。19204)葡萄糖对lac操纵子的影响β-半乳糖苷酶在乳糖代谢中的作用是把乳糖分解成葡萄糖及半乳糖。半乳糖在gal操纵子的作用下再转化成葡萄糖。将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中，大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发lac操纵子。葡萄糖对lac操纵子表达的抑制是间接的。一个大肠杆菌突变体，它在糖酵解途径中不能将葡萄糖-6-磷酸转化为下一步代谢中间物，这些细菌的lac基因能在葡萄糖存在时被诱导合成。这说明是葡萄糖的某些降解产物抑制了lacmRNA的合成，将葡萄糖的这种效应称为代谢物阻遏效应。215)cAMP与代谢物激活蛋白(CAP)大肠杆菌中，cAMP的浓度受葡萄糖代谢的调节。大肠杆菌在缺乏碳源的培养基中培养，细胞内cAMP浓度就高；在含葡萄糖的培养基中培养，cAMP的浓度就低。培养基中只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳源，cAMP的浓度也会很高。糖酵解途径中位于葡萄糖-6-磷酸与甘油之间的某些代谢产物是腺苷酸环化酶活性的抑制剂。代谢物激活蛋白(CAP)，又称为环腺苷酸受体蛋白(CRP)，由Crp基因编码，能与cAMP形成复合物。ACP(CRP)和cAMP是合成lacmRNA所必需的。22CRP蛋白为二聚体，每个CRP结合一个cAMP。CRP与cAMP形成复合物后才能结合到CAP位点。CAP位点位于-60bp处，邻近启动基因(P)。CAP结合位点的DNA序列有2个保守的5个碱基序列TGTGA。RNA聚合酶的α亚基的C端结构域(αCTD)与ACP位点附近的DNA序列结合。通过与αCTD的相互作用，cAMP-CRP复合物帮助RNA聚合酶结合到启动基因上，激活lacmRNA的转录。cAMP-CRP复合物是激活lac操纵子的组成部分。cAMP-CRP是不同于阻遏蛋白的正调控因子。lac操纵子受控于这两个相互独立的调控体系。23cAMP-CRP复合物结合于启动子上游，能使DNA双螺旋发生弯曲，有利于形成稳定的开放型启动子-RNA聚合酶结构。阻遏蛋白则是一个抗解链蛋白，阻止形成开放结构，而抑制RNA聚合酶的功能。lac操纵子正负调控的协调作用：负调控——受乳糖和阻遏蛋白调节正调控——受cAMP和CAP调节两种调控机制根据存在的C源性质和水平协同调节lac操纵子的表达。24257.2.3lac操纵子DNA的调控区——P、O区从已分离得到含有lac操纵子的DNA片段中发现，P区(即启动子区)一般是从I基因结束到mRNA转录起始位点下游5-10bp。而O区(即阻遏物结合区)位于-7~+28位，该区的碱基序列有对称性，其对称轴在+11位碱基对。实验表明，阻遏蛋白与O区的结合影响了RNA聚合酶与启动区结合形成转录起始复合物的效率。267.2.4lac操纵子中的其他问题lac操纵子中的lacA基因编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶，其作用是将乙酰辅酶A上的乙酰基转移到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。自然界中存在着许多种能被β-半乳糖苷酶降解的半乳糖苷分子，它们的分解产物往往不能被进一步代谢，很容易在体内积累。半乳糖苷衍生物在高浓度时是细胞正常生长的抑制物。半乳糖苷乙酰化后，即无毒。lacA基因产物虽然不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物质的积累。1)lacA基因及其生理功能272)lac基因产物数量上的比较在一个完全被诱导的细胞中，β-半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶的拷贝数比例为1:0.5:0.2。这个比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作为惟一碳源时细胞的需要。不同的酶在数量上的差异是由于在翻译水平上受到调节所致。这种调节有以下两种方式：lacmRNA可能与翻译过程中的核糖体相脱离，从而终止蛋白质链的翻译。在lacmRNA内部，A基因比Z基因更易受内切酶作用发生降解，在任何时候Z基因的完整拷贝数要比A基因多。283)操纵子的融合与基因工程操纵子在自然条件下可能发生融合。如lac操纵子与负责嘌呤合成的pur操纵子的偶联。pur操纵子位于lac操纵子的下游，中间只间隔了一个控制细胞对T6噬菌体敏感的tsx基因。tsxRZ-突变体：POZYAtsxPOpur结构基因缺失在这个体系中，pur操纵子被连接到lac操纵子的启动基因上，形成融合基因。用强启动子可使具弱启动子的转录增强而增加蛋白质的合成量。基因融合在基因工程中被广泛应用。297.3色氨酸操纵子与负控阻遏系统色氨酸操纵子负责色氨酸的生物合成，培养基中有足够的色氨酸操纵子关闭，缺乏时被打开。trp体系参与生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CAP的调控。色氨酸的合成分5步完成，每个环节需要一种酶。编码这5种酶的基因紧密连锁在一起，被转录在一条mRNA上，分别以trpE、trpD、trpC、trpB、trpA代表，编码邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶。30317.3.1色氨酸操纵子的结构调节基因(trpR)与结构基因不紧密连锁。操纵基因在启动子内。启动子和结构基因不直接相连，被前导序列(trpL)所隔开。前导序列编码前导肽和弱化子(衰减子)。trpDtrpCtrpBOPtrpEtrpA结构基因操纵基因trpL:编码前导序列编码前导肽衰减子trpR327.3.2色氨酸操纵子可阻遏的负调控trpDtrpCtrpBOPtrpEtrpA启动子操纵基因trpR脱辅基阻遏蛋白单体二聚体Trp是辅阻遏物

低浓度Trp或缺乏Trp时，脱辅基阻遏蛋白没有活性，不能与操纵基因结合，结构基因转录。mRNA33trpR启动子trpDtrpCtrpBOPtrpEtrpA操纵基因二聚体

高浓度Trp时，Trp与脱辅基阻遏蛋白结合，使其具有结合操纵基因的构象，阻遏结构基因转录。脱辅基阻遏蛋白单体trp阻遏蛋白二聚体阻遏基因转录34trpRtrpDtrpCtrpBOPtrpEtrpA脱辅基阻遏蛋白单体mRNAtrp分枝酸二聚体阻遏蛋白二聚体阻遏基因转录357.3.3弱化子与前导肽弱化子又称衰减子是DNA中可导致转录过早终止的一段核苷酸序列。在trpmRNA5'端trpE基因的起始密码前有一个长162bp的mRNA片段被称为前导区。当mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录。转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，这个区域就被称为弱化子。1)弱化子362)前导肽及前导mRNA序列衰减作用需要负载tRNATrp参与，这说明前导序列的某些部分被翻译了。前导序列中包括起始密码AUG和终止密码UG