黄芪丹参有效组分不同比例配伍对肾纤维化大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

黄芪丹参有效组分不同比例配伍对肾纤维化大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

肾微细胞上皮间质化（pmt）对肾纤维机化起着非常重要的作用。各种慢性肾脏病发展过程中,由于肾小管上皮细胞向成纤维细胞和成肌纤维细胞的表型转化,导致细胞外基质异常增多,从而加重肾小球硬化和肾小管间质纤维化的进程。黄芪丹参药对是临床应用治疗肾纤维化最常用的两味药物,两味药物配伍防治肾纤维化的实验研究目前还很少见,未发现其有效组分不同剂量配伍干预肾纤维化大鼠肾小管上皮细胞转分化的相关实验研究。本实验在于研究并揭示黄芪丹参药对有效组分不同剂量配伍对肾小管上皮细胞转分化过程的抑制作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1daw高效实验大鼠sd清洁级(SPF级)、健康雄性SpragueDawley(SD)大鼠,由广东省医学实验动物中心提供,体质量180~220g。动物许可证编号:SCKK-(粤)2008-0002。1.1.2关于sf-hq、sfds黄芪总皂苷、丹参总酚酸,陕西省森弗生物技术有限公司提供(批号分别为SF-HQ100427、SFDS100430);福辛普利,中美上海施贵宝制药有限公司提供(批号为1001091)。1.1.3大鼠-sma检测SP试剂盒、DAB显色试剂盒、苏木素,福州迈新公司提供。兔抗大鼠α-SMA多克隆抗体,北京博奥森生物科技有限公司提供。兔抗大鼠E-cadherin多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗、抗体稀释液,武汉博士德公司提供。1.1.4材料和硬件条件TB-718D生物组织自动包埋机、TK-218Ⅲ型恒温推片烤片机,湖北泰维医疗科技有限责任公司;ZT-12H生物组织自动脱水机,湖北孝感亚光用电子技术研究所;台式高速冷冻离心机(5810型),Eppendorf,德国;HPIAS-1000彩色图像分析系统,武汉同济医科大学千屏影像公司。1.2方法1.2.1大鼠的固定术根据文献方法建立大鼠肾纤维化模型。以3%戊巴比妥钠(2ml/kg)腹腔注射麻醉,麻醉成功后,固定大鼠,备皮,消毒,铺巾。在距脊柱约1~1.5cm,肋缘下做长约1~1.5cm纵行切口,逐层剥离皮下筋膜,切开肌肉,暴露出肾盂,找到右输尿管,将大鼠改左侧卧位,玻璃分针分离输尿管,取中段结扎,逐层缝合,关闭腹腔,再次消毒切口,无菌敷料覆盖包扎。1.2.2给药、药-药大鼠适应性喂养1周,随机分为正常组(n=8)和造模组(n=48)。造模后随机分为5组,分别为模型组(n=8)、黄芪丹参药对有效组分配伍1∶1组(n=10)、黄芪丹参药对有效组分配伍1∶2组(n=10)、黄芪丹参药对有效组分配伍2∶1组(n=10)及福辛普利组(n=10),第二天开始给药。药物用0.9%NaCl溶液配置成相应浓度,给药体积为10ml/kg,共灌胃14d。其中黄芪丹参药对有效组分配伍1∶1组(简称组分配伍1∶1组),每毫升含3.75mg黄芪总皂苷和4mg丹参总酚酸;黄芪丹参药对有效组分配伍1∶2组(简称组分配伍1∶2组),每毫升含3.75mg黄芪总皂苷和8mg丹参总酚酸;黄芪丹参药对有效组分配伍2∶1组(简称组分配伍2∶1组,每毫升含7.5mg黄芪总皂苷和4.0mg丹参总酚酸、福辛普利组(每毫升含0.66mg);模型组给予自由进食和等量蒸馏水灌胃。灌胃第14天后,在麻醉状态下,剖开动物腹腔,剥离全部肠组织,腹主动脉采血后取结扎侧肾脏,从中间分为两部分,1/2部分置于液氮中保存,1/2部分置于4%多聚甲醛中固定。取多聚甲醛固定组织块进行乙醇脱水、石蜡包埋后制成4μm石蜡切片,分别进行HE和免疫组织染色。1.2.3免疫组化检测肾组织e-cadhenin、-sma表达(1)肾组织病理:常规HE染色,镜下观察肾脏病变。肾小管间质损伤评分:采用Oikawa法半定量肾小管间质纤维化的程度,并根据程度评分,即0:正常或<25%,评0分;+:病变面积为25%~50%,评1分;++:50%~75%,评2分;+++:>75%,评3分。(2)肾功能:血浆尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)测定,均采用全自动生化分析仪测定。(3)免疫组织化学检测肾组织E-cadherin、α-SMA表达:采用SP法,E-cadherin为即用型,α-SMA为1∶50稀释,严格按照免疫组化过程进行操作。(4)α-SMA、E-cadherin灰度值:免疫组化阳性结果为细胞质及肾间质染成棕黄色或黄色颗粒,采用HPIAS-1000计算机图像自动分析系统对各组图像进行分析,每张切片在400倍视野下随机取5个视野,计算每个视野的平均灰度级,分为0~255级共256级,平均灰度值越高,表明其透光率越强,免疫组化染色越浅,阳性率越低。1.2.4多组数据统计分析采用SPSS13.0统计软件分析所得数据。各组数据以表示,多组资料间比较采用单因素方差分析,LSD法与Tamhane’sT2检验比较组间差异。以P<0.05为判断差异具有统计学意义。2结果2.1各组大鼠肾功能损害情况比较与正常组比较,其余各组Scr水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),而BUN水平差异无统计学意义(P>0.05),说明造模大鼠出现肾功能损害。与模型组比较,福辛普利组Scr水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);其余各治疗组Scr水平差异无统计学意义。与福辛普利组比较,各组分配伍组Scr水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);BUN水平差异无统计学意义(P>0.05)。各组分配伍组之间比较Scr、BUN水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。2.2各组大鼠病理改变2.2.1各组大鼠评分比较与正常组比较,其余各组评分值均升高,差异有统计学意义(P<0.05),说明造模大鼠肾组织病理损害严重。与模型组比较,福辛普利组评分值降低,差异有统计学意义(P<0.05);其余各治疗组评分值差异无统计学意义。与福辛普利组比较,各组分配伍组HE评分升高,差异有统计学意义(P<0.05)。各组分配伍组之间比较无统计学意义(P>0.05)。见表2、图1。2.2.2各组大鼠肾组织e-cadhenin表达比较,见表1E-cadherin表达:正常组肾组织E-cadherin呈强阳性表达,模型组呈弱阳性表达,而各治疗组肾组织E-cadherin阳性表达不同程度增强。见图2。E-cadherin半定量分析结果:与正常组比较,其余各组肾组织E-cadherin灰度值水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),说明造模大鼠肾组织E-cadherin阳性表达减少;与模型组比较,各治疗组E-cadherin表达灰度值水平有不同程度降低,差异有统计学意义(P<0.05),说明各治疗组大鼠肾组织E-cadherin阳性表达不同程度增强;组分1∶1组与福辛普利组比较,差异无统计学意义(P>0.05);组分配伍1∶2组及组分配伍2∶1组E-cadherin表达灰度值水平明显高于福辛普利组(P<0.05),说明福辛普利组和组分1∶1配伍组均具有增强模型组肾组织E-cadherin阳性表达作用,且疗效优于组分配伍1∶2组及组分配伍2∶1组。见表3。α-SMA表达:正常组、福辛普利组肾组织α-SMA灰度值水平较高,表明在肾小血管壁或肾间质细胞α-SMA有少量表达。模型组α-SMA表达主要存在于肾间质细胞及小血管壁,并随着肾纤维化的逐渐加重,肾间质细胞的增生,α-SMA灰度值水平降低,呈强阳性表达。组分配伍1∶1组、福辛普利组,α-SMA的表达灰度值明显升高,阳性表达明显降低,其阳性表达受到明显抑制,其余各治疗组对模型大鼠肾组织α-SMA表达有不同程度抑制作用。见图3。α-SMA半定量分析结果:与正常组比较,模型组及组分配伍2∶1组肾组织α-SMA灰度值水平降低,阳性表达增强,差异有统计学意义(P<0.05),说明造模大鼠α-SMA表达增多。福辛普利组、组分配伍1∶1组肾组织α-SMA表达灰度值水平明显高于模型组(P<0.05)。组分配伍1∶2组、组分配伍2∶1组肾组织α-SMA表达与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。说明福辛普利组、组分配伍1∶1组具有抑制肾组织α-SMA表达作用,而且效果相当,而组分组分配伍1∶2组、组分配伍2∶1组抑制肾组织α-SMA表达作用不明显。见表3。3不同药物配伍的干预uui大鼠肝肾t-crc-mfd的作用早期干预肾纤维化对防治终末期肾病发生,提高患者生活质量,具有重要意义。随着西医防治慢性肾脏病进展日渐深入,发现引起肾纤维化发生的分子机制EMT主要与TGF-β/Smad、Jak/Stat、Wnt/β-catenin等多条信号通路有关,抑制EMT发生,成为治疗慢性肾病的关键。在高糖、蛋白尿、肾毒性药物、尿毒素血清、移植肾肾病等导致肾纤维化发生的研究均涉及EMT的发生。EMT发生主要过程是肾小管上皮细胞E-cadherin表达下降,向成纤维细胞发生转化,成纤维细胞获得平滑肌细胞的某些表型,成为肌成纤维细胞,其标志物α-SMA表达增加。肌成纤维细胞产生并分泌大量细胞质基质,细胞质基质的过度积累而导致肾纤维化加重。近年来,中医药通过抑制肾纤维化过程中EMT发生的研究较多,主要采用中药单体、经典方剂、经验复方制剂等进行实验研究。在肾内科,黄芪注射液与丹参注射液经常单独或联合应用治疗慢性肾脏病而防治肾纤维化的发生发展,但未见黄芪丹参有效组分不同比例配伍干预UUO大鼠肾小管上皮细胞转分化的作用的相关研究。仅见赵建荣等采用黄芪当归合剂,朴胜华等采用黄芪、三七不同剂量配伍的通脉口服液进行肾纤维化治疗的相关研究。黄芪丹参配伍能够针对肾纤维化病机脾肾气虚、瘀血阻络而发挥补气活血之功效。本研究证实:黄芪