蒙医灸疗对大鼠海马衰老因子的影响

蒙医灸疗对大鼠海马衰老因子的影响

随着人口老龄化水平的提高，抗衰老是医学领域的研究主题之一。它也是提高生活效率、改善人类体质、适应重要器官功能、恢复身体环境平衡的基本要求。本研究依据蒙医文献记载,筛选了抗衰老特异性较强的顶会、火衰、胃、肾等4个穴位,通过C43灸疗方法探讨所选穴位之间的协同和拮抗作用。仪器、试剂与仪器选取3月龄健康SD大鼠60只,体质量(180±20)g,雌雄各半,购自北京大学医学部,合格证号:SCXK(京)2009-2011。所有大鼠均用标准饲料喂养,自由进水;饲养环境温度(22±2)℃,相对湿度50%-55%,人工控制室内照明,保持12h光照(8:00-20:00)黑暗(20:00-次日8:00)交替循环。UV-365型分光光度计(日本产)、隔水电热恒温培养箱PYX-DHS(上海市跃进农场医疗器械厂)、分析天平(上海精密科学仪器有限公司)、高速冷冻离心机(上海将来实验设备有限公司)、(4-20)℃或-80℃冰箱(美国产)、WELLWASH4MK2型酶标仪(芬兰产)、Morris水迷宫仪(上海欣软信息科技有限公司)。D-半乳糖,批号:20110614;乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)试剂盒,批号:20110721;多巴胺(dopamine,DA)试剂盒,批号:20110716;单胺氧化酶(monoamineoxidase,MAO)试剂盒,批号:20110720,均由南京建成生物工程研究所提供。组织病理学检查将SD大鼠适应性喂养1周后随机分成正常组(Z组),模型组(M组),顶会、火衰、胃穴组(A组),顶会、胃、肾穴组(B组),火衰、胃、肾穴组(C组)和顶会、火衰、肾穴组(D组),每组10只。Z组不造模、不施灸,连续42d颈背部皮下注射等量0.9%氯化钠溶液;M组和灸疗组均用5%D-半乳糖150mg/kg颈背部皮下每天注射1次。在造模期间,每周称大鼠体质量1次,并观察外部特征,如皮毛颜色、驼背、活动情况、怕冷、进食情况等。顶会穴:位于从两眉正中,往上划一线,再从两耳叶上缘正中往上划一线,此二线在头顶之交叉处。火衰穴:位于剑突尖直下2寸处及左右各1寸处,并列三穴。胃穴:位于第十二脊椎下凹正中处,从此点再向左右量1寸处各有一穴,并列三穴。肾穴:位于第十四脊椎下凹正中和再向左右量1寸各有一穴,三口并列。对Z和M组大鼠做固定处理,而对其他组从第7周开始施灸。参照文献方法,对灸疗组选定穴位,剪毛后施灸,涂凡士林以保护大鼠皮肤且便于固定艾炷。艾炷直径3mm、长1cm、灸垫厚度0.5mm,每次共施灸15min,1次/隔日,共灸21次。(1)定位航行试验:水温25℃左右,每日上、下午各4次,将大鼠面向池壁分4个象限放入水中,记录其在120s内寻找到平台的时间记为逃避潜伏期。如果大鼠在120s内未找到平台,则用手牵引其至平台上,让大鼠停留10s,再放回笼中,并记潜伏期为120s,历时5d。(2)空间探索实验:第6天撤除平台,任选一个入水点将大鼠放入,记录其120s内跨越原平台位置的次数。断头后在冰面上快速取出双侧海马,用0.9%氯化钠溶液冲洗,滤纸拭干,称重。将海马置于5mL玻璃匀浆器中,加入预冷的0.9%氯化钠溶液(按1:9重量比),并把管下部插入盛有冰块的容器中,充分研磨使组织匀浆化(约5-6min),制成10%的匀浆。匀浆4000r/min离心15min,取上清液置于干净试管内备用。取出海马后,立即取脾脏和胸腺,用0.9%氯化钠溶液洗净并称重。计算脾脏(胸腺)指数的公式为:脾脏(胸腺)指数=脾脏(胸腺)重量(mg)/体质量(g)。采用高效液相色谱加电化学(HPLC-ECD)方法测定DA含量;采用高效液相-柱后衍生化-电化学检测器(HPLC-RE-ECD)方法测定Ach含量;采用(比色法)方法测定MAO含量。DA比色波长为450nm,Ach为550nm,MAO为242nm。实验数据统计采用SPSS17.0软件处理。数据以表示,各组之间的比较采用q检验进行统计学分析。以P<0.05为差异有统计学意义。穴组不同配伍组da、ach和mao含量比较见表1。结果显示,造模后M组体质量增加变缓,与Z组比较,M组显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。三穴组灸疗以后,除D组外其他配伍组的DA和Ach含量均明显高于M组(P<0.01)。见表3。三穴组灸疗以后,除D组外其他配伍组的MAO含量均明显低于M组(P<0.01)。见表4。灸疗以后,除D组外其他灸疗组的脾脏、胸腺指数明显高于M组(P<0.05)。见表5。灸疗以后,除D组外其他灸疗组的学习和记忆力明显提高于M组(P<0.01,P<0.05)。穴位配伍的病理变化我国历代医家对衰老及养生有着丰富的理论和实践,认为阳气失常、阴气虚衰以及五脏气血亏虚为衰老主因,将灸疗用作养生保健和延缓衰老的重要手段。马良宵等研究发现,保健经穴对机体具有多方面、多环节、多水平的调整作用,能提高机体免疫力,从而达到良性调整、防病、抗衰老的作用。韦良玉等认为,可通过艾炷灸提高脑组织总SOD的活力从而提高学习记忆力,延缓脑组织老化。许焕芳等研究认为随年龄增长,免疫器官开始老化,免疫细胞及细胞因子逐渐发生改变,从而导致衰老发生。灸疗作用的实质为调整人体阴阳平衡,纠正其偏盛偏衰的病理现象,使亢者平,弱者强,恢复正常的机能状态;而蒙医理论认为,人体依赖赫依、希拉、巴达干动态平衡而维持生命运动,且三根(赫依、希拉、巴达干)之间的互相依存、制约使人体功能得以正常运转。造模后大鼠体质量变化及动作变迟缓、毛色枯黄、精神萎靡等外部特征与文献报道的衰老模型一致,表明本实验造模成功。已有研究表明,胸腺能够分泌多种细胞因子,促进T淋巴细胞成熟,对机体的免疫功能发挥重要作用;而脾脏是机体最大的免疫器官,含有大量的淋巴细胞和巨嗜细胞,是机体细胞免疫和体液免疫的中心。如表4所示,灸疗组(除D组)的脾脏、胸腺指数均明显高于模型组,表明可有效增强体质并提高机体的免疫功能。研究显示,在正常情况下大脑中的单胺类神经递质含量保持在一定水平;而出现衰老时,由于降解的单胺氧化酶的含量急剧增高,神经组织中的DA和Ach过量降解,含量下降,导致神经和内分泌功能衰变。由表2-表3可知,通过所选三穴组进行配伍灸疗可有效抑制单胺氧化酶的活性,延缓神经递质的降解,从而达到机体抗衰老作用,同时也对学习和记忆等脑的认识功能起重要作用。上述结果有效验证了蒙医文献记载的顶会、火衰、胃、肾等四穴位的抗衰老作用。需要指出的是,配伍时单穴抗衰老作用相抵消或不同穴位的作用途径并非相同,本实验中灸疗D组提示了临床上可能的配伍禁忌。类似结果在已有文献中略有报道,如张京晶等发现,穴性相同或有协同作用的穴位配伍使用可提高疗效,而穴性相反或有拮抗作用的穴位配伍,则不仅降低疗效,还可能会适得其反。本研究中,首次采用SD大鼠,观察蒙医配伍灸疗法对机体的抗衰老作用。SD大鼠与Wista鼠相比,生长发育快,对疾病的抵抗力较强,更适合于在抗衰老研究中做模型大鼠。另外,为观察蒙医灸疗中穴位之间的协同和拮抗作用,本研究首次通过三穴组灸疗,测定了DA、Ach、MAO等含量。与以往研究相比,采用更合理的配伍组合,所测指标也能较全面地反映对抗衰老作用的影响。人体的衰老机制非常复杂,而蒙医灸疗法可以多种途径达到抗衰老作用。目前蒙医配伍灸疗的抗衰老作用研究还处在初始阶段,后续研究中应培育更成熟的模型大鼠、