实验室常用微生物菌种分离和培养的简易方法

实验室常用微生物菌种分离和培养的简易方法

微生物实验材料，如细菌和细菌，通常需要一些方法。1.去大学微生物研究所、相关大学生物系或微生物教研室购买；2.去各级防疫站、车间、兄弟学校购买或要求的防疫材料。定期移植现有种子。但如果上述途径都无法实现或由于种种原因一时得不到现成的菌株,那么完全可以自己动手,进行微生物菌种的分离和培养。根据实验目的,对菌种的要求也不同。如果仅仅作为形态和染色的观察,简单的生理生化测定,分离和培养就比较简单,如果用于具体种、属和血清学鉴定,分离和培养就比较复杂。本文重点介绍作为一般用途即用于形态观察和染色试验用的几种常用菌种的分离和培养方法。1一般消毒在一般的微生物实验中经常使用到的菌种有:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、青霉、曲霉、根霉、毛霉等。2准备细菌运动实践有些实验,对菌种的要求并不高,如“细菌运动性观测”,实验要求了解鞭毛菌的运动情况,由于对具体的菌种无甚要求,可采用以下的方法来准备实验材料:在做“细菌运动性观察”实验前一天,可以找一些稻草或野草,剪碎装入三角瓶,加少量葡萄糖和氯化钠,并加适量水,在37℃培养箱中培养16～18小时备用。这样培养出来的细菌自然不是什么纯种,而是各种各样细菌的大杂烩,但却能满足我们实验的要求,可观察到各种细菌的运动方式。用上述方法培养的菌液不仅包括各种形态的细菌,同时还包括了各种类型的细菌,如革兰氏阴性菌和阳性菌,所以用这种活菌液作为革兰氏染色的实验材料,效果是相当理想的。因为我们可以同时观察到各种形态的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌,比仅仅用大肠杆菌(革兰氏阴性杆菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性球菌)要好得多。3细菌的分离和繁殖对于目的要求非常明确的实验,就必须提供具体的菌种。下面介绍几种实验室常用微生物菌种分离和培养的简便方法:3.1发酵菌种的确定大肠杆菌广泛存在于人和温血动物的肠道及粪便中,存在于自然界的水、土和空气中。一般可以用生活污水或水质较差的水沟、水池的水样作为样品。方法:取样品1mL,分别注入乳糖胆盐发酵管(内含10mL发酵液)(约5-6支),36±1℃,24小时培养,如有产气的,接种伊红美蓝琼脂平板36±1℃,18-24小时培养。挑取紫黑色带金属光泽、紫红色或粉红色的可疑菌落,进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,如革兰氏阳性,乳糖发酵管产气,可以基本确定为大肠杆菌。从伊红美蓝琼脂平板上挑取已证实为大肠杆菌的菌落,接种营养琼脂斜面,36±1℃,24小时培养,4-7℃冰箱保存备用。更简便的方法是直接挑取人畜粪便在伊红美蓝琼脂平板上划线分离,后期操作同上。乳糖胆盐发酵管:蛋白胨20克,猪胆盐5克,乳糖10克,0.04%溴甲酚紫水溶液25mL,蒸馏水1000mL,pH7.4。将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中,校正pH,加入指示剂,分装每管10mL,并放入一个小倒管,高压灭菌115℃15分钟。乳糖发酵管:除了不加胆盐,其他同乳糖胆盐发酵管。3.2细菌分离、浆凝固酶试验及结果金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界,如空气、土壤、水、生物体、工具及食品的原辅材料中,存在于人体鼻腔、咽部黏膜,并常常引起皮肤炎症。所以可直接用无菌棉拭在鼻、咽部采得样品,如直接采取皮肤炎症部位的脓血为样品效果更佳。由于金黄色葡萄球菌具有高嗜盐性,一般可使用含7.5%氯化钠的培养基作为增菌液,它亦是一种选择培养基。方法:把已采得样品的棉拭剪入30-50mL无菌生理盐水中,经过充分振摇后,用无菌吸管吸取5mL接种于7.5%NaCl肉汤50mL中,混合均匀,置36±1℃温箱中增菌18-24小时,然后将增菌培养物划线接种于却普曼琼脂平板上,36±1℃培养24小时,金黄色葡萄球菌在却普曼琼脂平板上产生的菌落较小,分解甘露醇,菌落周围呈黄色。挑取可疑菌落进行革兰氏染色并镜检,同时接种营养琼脂斜面,36±1℃培养24小时后,进行血浆凝固酶试验。形态:本菌为革兰氏阳性菌,排列呈葡萄状,无芽孢,无荚膜,致病性葡萄球菌菌体较小,直径约0.5～1μm。(血浆凝固酶试验:取0.25mL血浆与等量的生理盐水混合,取待检疑似葡萄球菌菌株24小时培养物一接种环接入该稀释血浆中,放36±1℃温箱或水浴中,每半个小时观察一次,观察6小时,如呈现凝固现象即为阳性。)从却普曼琼脂平板上挑取已证实为金黄色葡萄球菌的菌落,接种营养琼脂斜面,36±1℃,24小时培养,4-7℃冰箱保存备用。7.5%NaCl肉汤:蛋白胨10克,牛肉膏3克,氯化钠75克,蒸馏水1000mL,pH7.4。将上述成分加热溶解,校正pH,分装试管或三角烧瓶,高压灭菌115℃15分钟。却普曼琼脂平板:牛肉膏10克,蛋白胨10克,甘露醇10克,氯化钠75克,琼脂15克,蒸馏水1000mL,0.4%酚红水溶液6mL。将上述各成分除酚红外,加热溶解调节pH至7.4,加上酚红溶液,分装于三角烧瓶,以115℃15分钟高压灭菌,临用前倾注平板。3.3马铃薯葡萄糖培养基培养液母菌种酵母菌与人类关系密切,在酿造、食品和医药工业等方面均有重要应用。酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸性环境,如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上,特别是葡萄园和果园的土壤中。方法:取几颗鲜葡萄或少许苹果皮(勿洗),用无菌生理盐水冲洗,或直接浸入适量无菌生理盐水中,经充分振摇,然后用接种环沾取少量上述生理盐水于马铃薯葡萄糖培养基平板划线,25～28℃,4～7天培养,挑取少量乳白粘稠的单个菌落镜检,如发现单个个体较大(比细菌要大得多),圆形或卵圆形,有的有出芽状的,在高倍镜下可隐见其中的细胞核,初步可确定为酵母菌。挑取少量菌落接种马铃薯葡萄糖培养基斜面,25～28℃,4～7天培养,置4～7℃冰箱保存备用。由于酵母菌较易得到,一般可直接使用市售的鲜酵母或干酵母。马铃薯葡萄糖培养基:去皮马铃薯200克,葡萄糖20克,自来水1000mL。将马铃薯洗净,去皮,切成小块,加水煮沸30分钟,经纱布过滤,滤液加水至1000mL,加入葡萄糖和琼脂,熔解后分装三角瓶,8磅(112.6℃)20分钟灭菌。3.4分生孢子穗的分离培养青霉是产生青霉素的重要菌种,广泛分布于空气、土壤和各种物品上,常常生长在腐烂的柑橘皮上呈青绿色。一般可以从发霉的面包或霉变的柑橘上分离取得。方法:挑取霉变面包或柑橘上的青绿色孢子,接种到察氏培养基平板上,25～28℃,4～7天培养,挑取部分菌落于载玻片上镜检或直接在低倍镜下观察。发现分生孢子穗为扫帚状的便能确定。分生孢子穗因分生孢子梗的着生方式不同可以分为四类:即一轮青霉:分生孢子梗只有一轮分枝;二轮青霉:分生孢子梗产生两轮分枝;多轮青霉:分生孢子梗具三轮以上分枝;不对称青霉:分生孢子梗上不对称地产生或多或少轮层的分枝。挑取少量分生孢子接种察氏培养基斜面,25～28℃,4～7天培养,置4～7℃冰箱保存备用。察式培养基:蔗糖30克,NaNO33克,K2HPO41克,MgSO4·7HO20.5克,KCl0.5克,FeSO40.01克,琼脂15克,蒸馏水1000mL,高压灭菌115℃15分钟。3.5黄曲霉、黑曲霉、米曲霉的初筛结果曲霉广泛分布在谷物、空气和各种有机物品上,生长在花生和大米上的曲霉,有的能产生对人体有毒的真菌毒素。方法:取2-3颗霉变的花生米(霉变的花生几乎均含有黄曲霉),把花生掰开,放入装有10mL无菌生理盐水的试管中,振摇几分钟后,然后用接种环沾取少量上述生理盐水接种于察氏培养基平板,25～28℃,4～7天培养,挑取部分菌落于载玻片上镜检或直接在低倍镜下观察。如发现分生孢子穗为头状,并具有足细胞,可基本确定为曲霉。根据分生孢子穗的颜色可初步确定为黄曲霉、黑曲霉或米曲霉。挑取少量分生孢子接种察氏培养基斜面,25～28℃,4～7天培养,置4～7℃冰箱保存备用。3.6发酵或干霉根霉在自然界分布很广,空气、土壤以及各种器皿表面都有存在。并常常出现于淀粉质食品上,引起馒头、面包、甘薯等发霉变质,或造成水果蔬菜腐烂。由于根霉是食用甜酒曲的主要菌种,亦可从酒曲中分离到。方法:把酒曲(可从食品店购得)碾碎,(或用霉变的馒头、面包),称取1克,放入9mL无菌生理盐水,摇匀,制成1:10的稀释度;用无菌吸管从1∶10的稀释度中吸取1mL注入9mL无菌生理盐水,摇匀,制成1:100的稀释度。用无菌吸管从1∶100的稀释度中吸取1mL注入9mL无菌生理盐水,摇匀,制成1∶1000的稀释度;然后用接种环沾取少量1:1000的稀释度的稀释液接种于马铃薯葡萄糖培养基平板,25～28℃,4～7天培养。挑取部分菌落于载玻片上镜检或直接在低倍镜下观察。如发现有黑色的孢子囊,有假根,孢子囊梗直接从假根处生出,有匍匐枝,即为典型的匍枝根霉,即黑根霉,俗称面包霉、米根霉。挑取少量孢囊孢子接种马铃薯葡萄糖培养基斜面,25～28℃,4～7天培养,置4～7℃冰箱保存备用。3.7马铃薯葡萄糖培养基的制备毛霉分布于土壤、肥料中,也常见于水果,蔬菜以及各种淀粉性食物和谷物上,引起霉腐变质。方法:取豆腐胚(老豆腐或豆腐干2×2×2cm)放一小碟内,通风保存12～24小时,置15～18℃温箱5～7天,待外观白色菌丝长遍整个豆腐胚,挑取少许菌丝接种于马铃薯葡萄糖培养基平板,25～28℃,4～7天培养,挑取少许菌丝于载玻片上镜检。毛霉是低等