两个盐单胞菌属菌株的生物学特性分析

两个盐单胞菌属菌株的生物学特性分析

嗜盐菌是一种不同于旧细胞菌的极端环境微生物，可以在含有0.32%nacl的环境中生长。在20世纪80年代，分类混乱。只有海生作为一个独特的平均嗜盐菌，其中一个是在威迪先后从盐生厂发现的，称为海生嗜盐菌。此后，许多中度嗜盐菌被划分为其他物种，如德莱士菌、假单胞菌和假单胞菌。随着中度嗜盐菌分类的推进，许多相关品种被划分为相应的科和属。根据对16种顺序性遗传多样性和耐盐基因的一般分析，dubson等人将单胞菌科分为体针菌科，而德莱士菌和盐弧菌被归类为单胞菌科。由于中度嗜盐菌具有广泛的适应性，因此许多其他生物所不具有生理特征，因此具有研究和应用价值。近年来，中国有几篇报道，对遗传多样性和耐盐基因的克隆进行了研究和报道。在这项工作中，我们报道了从青岛附近生产海生物盐的盐渍中分离出的两类中度嗜盐菌cm1和cm4的生理生化特性以及物种分化情况。1材料和方法1.1培养基和培养方法菌株CM1和CM4由青岛附近所产海产品的盐渍中分离得到.富集和分离培养基采用CM培养基,液体培养在250mL三角瓶中装50mL温培养基,37℃摇床培养(220r/min).固体培养于加了少量蒸馏水的塑料袋中,培养两周后挑选单菌落,反复划线,直至获得纯菌.分离之后的培养均采用ATCC213培养基(g/L:MgSO4·7H2O10,KCl5,CaCl2·6H2O0.2,酵母提取物10,Tryptone2.5,NaCl180),37℃,摇床振荡培养(120r/min);固体培养基加琼脂18～20g/L,pH7.0,倒置平板培养,温度37℃.1.2菌体形态观察CM1和CM4在ATCC213液体培养基中培养7天后,用相差显微镜观察活菌体,革兰氏染色及电子显微镜等方法确定菌体形态.牛奶—盐—琼脂平板划线,37℃暗箱培养几天后观察菌落形态特征.1.3测量1.3.1生长条件用液体培养基接种并计时,一定时间间隔取样,耐盐试验时测OD460nm;最适Mg2+时测OD540nm.1.3.2薄层层析对于rf值的影响取30mL细菌培养液,离心(3500r/min)收集菌体,真空干燥后装入试管,分别加入3mL甲苯,3mL甲醇和0.1mL浓硫酸,于50℃水浴中水解15h,取上清液20μL进行薄层层析(层析板用1.7g硅胶溶于10mL0.5%的羧甲基纤维素钠倒板,于110℃活化1h)测定Rf值.1.3.3培养基od值的测定采用不同浓度NaCl梯度的ATCC213液体培养基,37℃摇床振荡培养CM1和CM42～7天,用7320型分光光度计于460nm测OD值.1.3.4抗菌素的筛选将分别浸有青霉素、四环素、潮霉素、链霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素和利福平等抗生素的厚滤纸片放在预先涂布好细菌的培养基上,于37℃培养CM15天,CM42天后,观察抗菌素对它们有无抑制作用.1.3.5菌悬液的制备将Mg2+按以下浓度梯度加入CM培养基中:15,20,25,30,35,40,45,50,55,60mmol/L.接入菌种,于37℃在摇床上震荡培养5天.测所得菌悬液的OD540nm值.1.3.6其他生理生化特征方法参考《伯杰细菌鉴定手册》及《常见细菌系统鉴定手册》中的方法.1.3.7蒸馏水处理将细菌培养液离心,弃上清液,加蒸馏水摇匀,观察粘度或镜检.2结果2.1革兰氏染色阴性菌株bCM1和CM4均为杆状,大小分别为(0.3～0.4)μm×(2.1～3.2)μm和(0.6～0.7)μm×(1.0～2.0)μm,革兰氏染色阴性,但CM1具有鞭毛,不能运动,而CM4则具有一根鞭毛,能够运动(图1a,b).两者的菌落均为乳白色,表面光滑,湿润,两面颜色一致,边缘整齐.CM1培养3天后菌落大小为1mm,而CM4培养1天即可达1mm.2.2.1cm1和cm4的生长CM1的最适生长pH值为9.0,而CM4的最适生长pH值为7.7;最适Mg2+浓度,CM1为60mmol/L,CM4为40mmol/L.在NaCl低于2%的情况下,CM1和CM4需要在Mg2+浓度达到50mmol/L时才能够生长;在NaCl浓度为10%的情况下,CM1还需要Mg2+浓度达到45mmol/L才能生长,而对CM4而言,只需要有15mmol/L的Mg2+浓度就可以生长.在最适生长条件下,CM1的对数生长期出现在70h左右,而CM4在20h左右.对两个菌株长时间(>10天)进行培养,CM1在达到吸光度为0.7左右时即不再增加,而CM5则会持续生长,并出现絮凝状沉淀,最终菌液变为褐色而出现细菌的大量死亡.2.2.2盐浓度不适宜生长CM1和CM4的最适NaCl浓度均为12%,在盐浓度低于2.5%时不生长,但明显可见的是CM1的生长速度要低于CM4(图2).两个菌株经过蒸馏水处理之后均不发生破裂.2.2.3不稳定因素:四环素、潮霉素不敏感,对四环素、潮霉素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对潮霉素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对潮霉素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对潮霉素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对潮霉素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对潮霉素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对潮霉素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对四环素不敏感,对潮霉素CM1对链霉素、红霉素、氯霉素、利富平、氨苄青霉素、卡那霉素敏感,对四环素和潮霉素不敏感;CM4对氨苄青霉素、四环素、潮霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素不敏感,且在四环素中生长更旺,对氯霉素和利富平敏感.2.2.4甘油二醚衍生物的斑射法检测薄层层析结果分析表明,CM1和CM4没有区别,均未呈现甘油二醚衍生物的斑点,而具有非羟基化的脂肪酸甲酯斑点,即迁移率均大于0.6,而对照的嗜盐古细菌的迁移率约为0.2(见图3).2.2.5糖酸类的碳源在所测试的有机物当中,包括半乳糖,蔗糖,纤维二糖,甘露糖,葡萄糖,果糖,乳糖,葡聚糖,鼠李糖,甘露醇,肌醇,山梨醇,CM1仅能利用果糖作为惟一碳源生长;而CM4可以分别利用甘露糖,鼠李糖和乳糖作为惟一碳源生长.2.2.6淀粉的制备在所进行的其他生理生化实验中CM1和CM4均表现一致:不水解淀粉,不液化明胶,不生成H2S;氧化酶和接触酶阴性,吲哚实验阴性,而尿酶、过氧化氢酶和精氨酸双水解酶阳性,硝酸盐还原实验阳性.3新种和配种的可能是cm4的生物进化产物上述试验结果表明,CM1和CM4菌株的特征符合盐单胞菌属的特征,即能在含2.5%～25%NaCl的培养基中生长,其最适NaCl浓度为12.5%,且在蒸馏水中不发生自溶,细胞膜含非羟基化的脂肪酸甲酯,而不含甘油二醚衍生物.为革兰氏阴性杆菌,菌落白色,不含色素.经与该属已知的7个种相比较(表1),发现与这两个菌株的生理生化特征有着显著的差异,因而有可能是新种.当然,这还有待于DNA杂交以及16SrDNA序列分析以后才能最终作出结论.就这两个菌株而言,它们在大多数生理生化特征上相似,仅在运动性、菌体大小、对Mg2+的需求、药敏实验以及对有机物的利用上有所差异,这表明两个菌株在系统分类上亲缘关系非常接近,甚或就是一个菌种的不同亚种或生态型.考虑到其生存的特殊环境,其分化可能是微生物在进化稳定策略选择上的不同造成的,即CM1可能属于K-对策者,其菌体较大,生长缓慢,不能运动,群体发育到一定程度后即停滞.与此相反,CM4菌体较小,生长迅速,能运动,种群发育无节制,因而可能采用了r-对策.