第七章 细胞培养及动力学1

第七章

细胞培养技术及动力学

Operationofbioreactor反应器操作1.Batchoperation间歇反应Periodsofoperationforbatchoperation1.Batchoperation2.Semi-continuousorfed-batchoperation半连续操作3.Continuousoperation连续操作本章主要分析讨论间歇培养和连续培养这两种基本方法，然后对其它培养方法进行扩展讨论。7.1微生物反应过程的计量学化学计量学：是对化学反应的组成和化学反应转化程度的数量化研究。A+BC+D元素平衡法

化学计量学反应工程学反应热力学反应动力学根据化学计量学，可知有关反应过程中各种反应组分的数量关系。研究化学计量学的目的是对反应过程进行控制和优化，争取获得最大的经济收益。

微生物反应过程的计量学：碳源（多种）+氮源（多种）+无机盐（多种）+有机生长因子（多种）+水+氧气细胞+主产物+副产物（多种）+二氧化碳对于微生物反应过程，由于参加反应的组分多，代谢途径错综复杂，同时微生物在生长，并且微生物菌体也不能用摩尔—摩尔的对应关系表示其计量关系。所以要用元素平衡的方法对微生物反应进行计量，将是十分复杂和困难的。工程上又不能回避这个问题，每一个工业化的微生物反应过程都需要计量。人们提出了一个相对简单的方法，就是引入得率系数（Yieldcoefficients）的概念，作为描述微生物反应中计量关系的宏观参数。得率系数有以下几种定义：1、对基质的细胞得率Yx/s(Monod提出的)Yx/s==生成细胞的质量消耗基质的质量△x-△s

在分批培养时，培养基的组分在不断地变化，因此在培养过程中细胞得率系数不能视为常数，在某一瞬时的细胞得率称为微分细胞得率（或者称为瞬时细胞得率）。分批培养过程，总的细胞得率为：Yx/s＝x0、s0：反应开始时细胞和基质浓度xt、st：反应结束时细胞和基质浓度xt-x0s0-st2、对碳的细胞得率Yc考虑碳源基质时，无论是需氧还是厌氧培养，宏观上碳源的一部分被同化为细胞组成物质，其余部分分别被异化、分解为二氧化碳及其它代谢产物。为了表示由碳源同化为细胞组成物质过程的转化效益，采用对碳的细胞得率YcYc=

Yc<1

一般在0.4~0.9左右的范围内。生成细胞量×细胞含碳量基质消耗量×基质含碳量3、对ATP生成的细胞得率YATP微生物通过基质的氧化而获得细胞合成、物质代谢、物质传递过程等生命活动所必需的能量。但是它并不是利用了基质氧化的全部能量，而只有在氧化反应中以生成ATP形式获得自由能，被微生物生命活动所利用，其余部分作为反应热释放到环境中。据此，ATP的生成量和细胞生长量有关联，以异化代谢过程中ATP的生成量作为细胞得率的基准。YATP表示为：YATP＝碳源对菌体的得率消耗1mol碳源由分解代谢产生ATP的摩尔数根据大量实验发现，在厌氧培养时，YATP值与微生物、基质的种类无关，基本上为常数，YATP=10YieldcoefficientsBiomass/substrate:Yx/s=-△x/△sProduct/substrate:Yp/s=-△p/△sProduct/biomass:Yp/x=-△p/△x7.2微生物反应动力学的描述方法

细胞生长动力学微生物反应动力学反应基质消耗动力学代谢产物生成动力学1、模型的简化细胞的生长、繁殖代谢是一个复杂的生物化学过程。该过程既包括细胞内的生化反应，也包括胞内与胞外的物质交换，还包括胞外的物质传递及反应。该体系具有多相、多组分、非线性的特点。多相指的是体系内常含有气相、液相和固相；多组分是指在培养液中有多种营养成分，有多种代谢产物产生，在细胞内也具有不同生理功能的大、中、小分子化合物；非线性指的是细胞的代谢通常需用非线性方程来描述。FreshMediaFeedDissolveO2SensorThermocoupleInletAirFlowExitGasFlowAcid/baseAntifoampHSensorLevelSensorAgitatorSparserExitLiquidFlow同时，细胞的培养和代谢还是一个复杂的群体的生命活动，通常每1ml培养液中含有104~108个细胞，每个细胞都经历着生长、成熟直至衰老的过程，同时还伴有退化、变异。因此，要对这样一个复杂的体系进行精确的描述几乎是不可能的。为了工程上的应用，首先要进行合理的简化，在简化的基础上建立过程的模型。要简化的内容有以下几点：①微生物反应动力学是对细胞群体的动力学行为进行描述。②不考虑细胞之间的差别(Treatedallcellsasequivalent)，而是取其性质上的平均值。（在此基础上建立的模型称为非确定论模型Unsegregated）。③在细胞的生长过程中，细胞内各种成分视为以相同的比例增加，而且忽略环境的变化对菌体组成的影响。两个概念：均衡生长和非结构模型。在细胞的生长过程中，如果细胞内各种成分均以相同的比例增加，则称为均衡生长；那么非均衡生长呢？细胞生长时胞内各组分增加的比例不同，称为非均衡生长。结构模型：细胞的组分是复杂的，有蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸、维生素等，这些成分的含量大小随环境条件的变化而变化。如果是在考虑细胞组成变化的基础上建立的模型，则称为结构模型，它能从机理描述细胞的动态行为。在结构模型中，一般选取RNA、DNA、糖类及蛋白质的含量作为过程的变量，将其表示为细胞组成的函数。但是，由于微生物反应过程极其复杂，加上检测手段的限制，缺乏可直接在线测量的传感器，给动力学研究带来了困难，致使结构模型的应用受到了限制。如果把菌体视为单组分，则环境的变化对菌体组成的影响可被忽略，在此基础上建立的模型称为非结构模型。它是在实验研究的基础上，通过物料衡算建立起经验或者半经验的关联式。Structured-“detailed”intracellulardescriptionUnstructured-“simple”intracellulardescription从模型的简化考虑一般采用：均衡生长的非结构模型2、反应速率的定义

常采用两种速率概念：绝对速率和比速率①绝对速率（又简称为速率）细胞生长率rx=基质消耗速率：rs=产物生成速率：

rp=dxdt-dsdtdtdp这些速率的单位：g/L·h②比速率

Specificgrowthrate比生长速率μ=[h-1]基质消耗比速率：[h-1]产物生成比速率：[h-1]比速率和细胞量有关，比速率的大小反应了细胞活力的大小。dxdt1dxdtx1dxdtx1dsdtx1dsdtSection2.Batchcultureandkinetics分批培养：是指在灭菌后的培养基中，接种微生物（某种），开始在一定的条件下培养微生物，在培养过程中不再向培养基中加入或移去主辅物料（如果是需氧微生物，则需不断通风供氧）的培养方式。分批培养的最大特点是：反应体系的微生物浓度和生理状态随培养时间变化，反应体系中的营养成分和代谢产物亦随培养时间变化。2.1MicrobialgrowthkineticsMicrobialgrowthkineticsdescribedhowthemicrobegrowthinthefermenter.Thisinformationisimportanttodetermineoptimalbatchtime.MicrobialgrowthkineticsThegrowthofmicrobesinafermentercanbedisassembledintofourstages:-Lagphase-Logphase-Stationaryphase-DeathphaseMicrobialgrowthkineticsLagphase-Thisisthefirstphaseinthefermentationprocess.-Thecellshavejustbeeninjectedintoanewenvironmentandtheyneedsometimetoadjustaccordingly.-Cellgrowthisminimalinthisphase.MicrobialgrowthkineticsLogphase-Thesecondphaseinthefermentationprocess.-Thecellshaveadjustedtotheirenvironmentandarapidgrowthtakeplace.-Cellgrowthrateisthehighestinthisphase.MicrobialgrowthkineticsLogphase-Atsomepoint,thecellgrowthratewillleveloffandbecomeconstant.-Themostlikelycauseofthisleveloffissubstratelimitedinhibition.-Substratelimitedinhibitionmeansthatthemicrobesdonothaveenoughnutrientsinthemediumtocontinuemultiplying.MicrobialgrowthkineticsStationaryphase-Thisisthethirdphaseinthefermentationprocess.-Thecellgrowthratehasleveledoffandbecomeconstant.-Thenumberofcellsmultiplyingequalstothenumberofcellsdying.MicrobialgrowthkineticsDeathphase-Thefourthphaseinthefermentationprocess.-Thenumberofcellsdyingisgreaterthanthenumberofcellsmultiplying.Thecauseofthedeathphaseisusuallythatthecellshaveconsumedmostofthenutrientsinthemedium,andthereisnotenoughnutrientsleftforsustainability.Mediaforindustrialfermentation

Themediaisthefeedsolution-Itmustcontaintheessentialnutrientsneededforthemicrobetogrow.Factorsneedforconsiderationwhenchoosingmedia:-Qualityuniformityandavailability.-Ensuretherearenoproblemswithmediaprepareorotheraspectsofproductionprocess.

Ex.Canemolasses,beetmolasses,cerealgrains.Thedevelopmentofinoculaforindustrialfermentation

Theinoculumisthestarterculturethatisinjectedintothefermenter.-Itmustbeofsufficientsizeforoptimalgrowthkinetics.Sincethefermenterforproductioninindustrialfermentationissolarge,theinoculumvolumhastobequitelarge.-Aseedfermenterisuauallyrequiredtoproducetheinoculum.-Theseedfermenter’spurposeisnottoproduceproduct,buttoproduceinoculum.Aboutlagphase在发酵工业生产中，为了提高生产效率，缩短生产的周期，希望延迟期缩短，要达到该目的，应一般遵循下列规则：(1)接种的微生物应尽可能是高活力的（要用处于指数期的微生物作种子）。(2)用于培养种子的介质和条件应尽可能接近生产上使用的发酵液组成和培养条件。(3)采用大接种量。因细胞内部的某些维生素和辅酶等生长素，向周围培养液发生过多的扩散，从而降低细胞的活性，延长延迟期。About