第一章 基因工程概述

基因工程原理GeneEngineeringWelcometoGeneEngineering主要参考书杨玉珍.现代生物技术概论.河南大学出版社.2004吴乃虎.基因工程原理.北京科学出版社.孙明.基因工程.高等教育出版社.2006常重杰.基因工程原理与应用第一章基因工程概述2006年全球转基因农作物种植面积突破1亿公顷，10年间种植面积增长了60多倍。尽管转基因蔬菜的安全性还没有得到完全的认可，但是科学家们还在不断地展开新的研究，希望能培育出更多品种的优质转基因蔬菜。由于转基因蔬菜具有产量高、口感好、抗虫害、适应能力强等优点，不少科学家预测，越来越多的转基因蔬菜将进入人们的菜篮子，也有一些具有药用价值的转基因蔬菜将出现在医生的处方单上。.日本一家研究所最近培育成功一种转基因生菜，其含铁量要比一般生菜高出将近一倍。这种转基因生菜是把大豆的铁蛋白基因植入生菜细胞中而培育出的，因而增强了生菜中铁质的含量。其含量每克生菜中为370—380微克，比一般生菜品种高出约一倍。生菜中的维生素C含量高，有利于人体吸收铁质。按照全部铁质被人体吸收计算，成年人每天只要吃半棵这种生菜，就可满足生理需要。目前，世界上约有3.5亿人感染乙型肝炎，而通常的防治方法是采用混合疫苗接种。但是，这种方法成本高，培养并提纯疫苗费时费力。为此，德国吉森大学的研究人员从实用角度考虑，选择了种植简单、贮存方便的胡萝卜作为载体，将乙肝病毒的表面蛋白基因注入胡萝卜基因，同时通过一种催化剂提高胡萝卜基因中乙肝病毒蛋白的浓度。研究人员介绍，这种转基因胡萝卜外表与普通胡萝卜没有差异，只是在成熟之前需利用一种荷尔蒙激活其基因，使其释放出更大量的肝炎疫苗成分。遭到玉米螟侵害和真菌感染的普通玉米(左)与转抗病基因玉米(右)

欧洲：转基因食品再度引发是非争议你还敢吃么

2008年1月15日飘着玫瑰花香的新型转基因西红柿诞生

以色列科学家开发出一种新型转基因西红柿，闻起来有玫瑰花和柠檬的香味。相关论文在线发表于《自然—生物技术》上。

进行该项研究的是以色列NeweYaar研究中心的EfraimLewinsohn和同事。他们向西红柿中导入了一种柠檬罗勒（Ocimumbasilicum）基因，该基因能够制造一种香叶醇合酶（geraniolsynthase），从而使西红柿产生类似柠檬的芳香气味。

真正蓝玫瑰面世转基因技术造就

2008年11月1日，转基因蓝玫瑰亮相日本东京国际花卉博览会。近年出现在花卉市场上的蓝色玫瑰，实际上是采用染色技术培育而成的白玫瑰，而在日本东京国际花卉博览会上亮相的世界首批转基因玫瑰才是真正的蓝玫瑰，这种玫瑰被植入三色紫罗兰所含的一种能刺激蓝色素产生的基因，花瓣因而自然呈现蓝色。亨氏米粉转基因风波

本以为随着农业部检测报告的公布，亨氏将可摆脱“婴儿米粉含转基因成分”指责的困扰，但亨氏中国总裁唐佳敦实在没有想到：2008年3月8日，国际环保组织“绿色和平”再次向媒体披露，最近抽检的22个亨氏米粉样本中，5个样本被检测出含转基因稻米成分。而绿色和平这次委托的检测机构，正是上次亨氏委托的香港基因晶片开发有限公司。“我们4月2日拿到最后一份检测报告。”马天杰说，5个被检出含转基因成分的产品不仅包括此前披露的保质期至2007年3月12日（K/A）的批次，而且还涉及保质期至2007年5月13日（E/A）等批次的亨氏米粉产品，其中3个产品被进一步证实含有未经批准的转Bt基因水稻。

神话成现实——变绿叶为鲜花

美国和墨西哥科学家共同完成的，他们通过一系列的基因实验获得了成功。在实验中他们发现一种芥子植物的所有基因中有五个是负责花瓣的生成的，而它们的生长基础与叶子完全相同，在叶子中也可发现这些基因，但它们已经有所变形。科学家们把叶子中的相关基因进行了改变，把整个叶子也变成了花瓣。转基因动物

2009年8月5日，四只身体发出绿色荧光的小老鼠在广州动物园展出。这些来自中山大学实验室的老鼠是通过转基因方法植入了绿色荧光蛋白，这也是2008年诺贝尔化学奖的技术首次应用在广州的动物园展览中。看看新奇的转基因生物1、猕猴特拉2000年，实验室首次成功克隆了一只叫做特拉的猕猴，后来科学家们陆续克隆了多只猴子，可用于研究人员测试糖尿病等病症。2、克隆猪美国实验室引入基因改良猪，使这些克隆猪能够生长出适合人类的器官和细胞组织。此次一共克隆了5头雌性猪，其中最大的一头叫做米莉，它们是2000年美国一家生物公司成功克隆的。3、鲤鱼3、鲤鱼1963年，一条亚洲鲤鱼被成功克隆；十年之后，科学家童第周又克隆了一条欧洲鲤鱼。4、多利绵羊1996年，一只名叫多利的绵羊被成功克隆诞生，这只雌性绵羊一直存活了6年。这是世界上第一只被克隆的哺乳动物，它被认为是人类克隆研究领域上最大的成功，之后数以百计的类似多利的哺乳动物被克隆出来。5、老鼠库姆利纳5、老鼠库姆利纳2000年，科学家在美国夏威夷成功克隆一只老鼠，这只老鼠被命名为“库姆利纳”（Cumulina），它一直存活了两年7个月。据悉，这在克隆研究领域是一项重大突破。6、母牛诺托和卡加这两头母牛是在1998年被成功克隆的，随后克隆了数千头母牛，这是日本克隆技术上的最大成果，这项技术也为其他克隆技术生产出更好的肉质和牛奶做出巨大贡献。7、山羊米拉山羊米拉是在1998年克隆的，当时它和自己的姐妹们是从美国实验室被制造出来，科学家利用家畜克隆技术生产对人体有益的药物成份。8、欧洲盘羊奥姆布雷塔2000年，一只叫做奥姆布雷塔的欧洲盘羊被成功克隆，科学家这样做是为了营救目前世界上数目稀少的欧洲盘羊，避免它们从地球上灭绝消失。9、野牛诺亚2001年，一只叫做诺亚的亚洲野牛被成功克隆，据悉，近年来亚洲野牛的数量锐减。诺亚由于痢疾只存活了两天。10、克隆猫科毕这只名叫科毕的猫于2001年成功克隆，从此开辟了宠物克隆市场，并最终形成了克隆宠物的国际性行业。中国完成世界首例转基因克隆兔实验家兔的克隆是一个世界性难题。由于兔子和人在生理上较为接近,克隆兔的出现,可将其作为帮助人类筛选药物、研究遗传学疾病的“动物模型”,有助于研究一些人类遗传疾病。该研究由上海交通大学医学院附属新华医院发育生物研究中心与中国农业科学院北京畜牧兽医研究所国家畜禽分子遗传育种中心合作完成。我国完成的世界首例转基因克隆兔到2007年14日已存活3个月。日前在上海通过分子生物学鉴定,结果显示,实验兔含有外源的绿色荧光蛋白基因,证明其为转基因克隆兔。左为克隆兔，右为代孕兔科学家培育转基因山羊羊奶可产含人奶成份新浪科技讯北京时间2009年2月14日消息，据英国《每日邮报》报道，目前，俄罗斯和白俄罗斯科学家正在培育转基因山羊，所产羊奶含有在人奶中发现的同样成分——乳铁蛋白。他们表示，对于无法喂奶的母亲来说，这项突破可以帮助她们的宝宝享受母奶所能带来的全部益处。科学家认为，从2009年底，也就是转基因母山羊发育成熟时起，他们将获得含量更高的乳铁蛋白，超过在人奶中发现的数量。白俄罗斯国家科学院的庇奥特·维特斯亚兹(PyotrVitsyaz)博士说：“这项新计划旨在生产含有人类蛋白的羊奶，同时也可用于药物研制。”科学家指出，相关药物可用于治疗癌症、免疫及消化系统疾病。俄罗斯科学院转基因库负责人伊格尔·古尔德曼(IgorGoldman)说：“人奶中所含的乳铁蛋白是一种天然抗生素，可帮助自身并不具备成熟免疫系统的婴儿提高免疫力。”基因本身也是一个产业Rockfeller大学将人肥胖基因出售0.2亿美元（1995年3月）Amgen公司将FKBP神经免疫因子配体转让达3.29亿美元（1997年）Millennium公司以4.65亿美元向Bayer公司转让225种基因的开发权（1998年9月）一、基因工程的概念1.基因工程的概念基因工程也称为基因操作或DNA重组技术，是20世纪70年代以后兴起的一门新技术。

基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定地繁殖。基因工程创造新生物，并给予新生物以特殊功能。通过基因操作来定向改变或修饰生物体或人类自身,并具有明确目的的活动称为基因工程。主要原理是应用人工方法把生物的遗传物质，通常是脱氧核糖核酸（DNA）分离出来，在体外进行切割、拼接和重组，然后将重组了的DNA导入某种安全无害宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传特性，有时还使新的遗传信息在新的宿主细胞或个休中大量表达，以获得基因产物（多肽或蛋白质）。

目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线基因操作（genemanipulation）：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。仅将基因作为一段DNA分子来操作，进行分析、修饰或转移属于生物化学或遗传学的范畴只有当基因能够进行大量、可操作性的扩增时才进入基因操作的范畴基因工程通过基因操作来实现，基因操作是实现基因工程的必需途径基因重组和基因工程之间关系：重组DNA技术是用酶学方法将不同来源的DNA在体外切割、连接、组成一个杂合DNA分子的技术。基因工程是通过基因重组来实现，但基因重组并不都是严格意义上的基因工程基因工程专指为实践应用而进行的基因重组事件，产生的基因工程体可以是生物反应器（如生产酶或活性物质等）改变了生物性状的工程体（改良生物体品质）2.基因工程的诞生与发展

第一个进行基因重组的是美国斯坦福大学的PaulBerg及其同事，他们于20世纪70年代把大肠杆菌和病毒的DNA连接起来1973年美国加里福尼亚大学的赫伯．博耶(HerbertBoyer)和斯坦福大学的斯坦利．科恩(stanleyCohen)为首的研究小组成功的进行的两个基因重组实验第一次实现了基因工程的实践，揭开了基因工程的序幕基因工程诞生的理论基础20世纪40年代，确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题。20世纪50年代，揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递问题。20世纪50年代末期和60年代，相继提出了“中心法则”和“操纵子学说”，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息流向和表达问题。2.1基因是基因重组的物质基础

孟德尔基因作为独特的独立单位而代代相传。细胞中有成对的基本遗传单位，在杂种的生殖细胞中，成对的遗传单位一个来自雄性亲本，一个来自雌性亲本，形成配子时这些遗传单位彼此分离。1909年，丹麦生物学家约翰逊（WilhelmLudwigJohannsen，1857～1927）根据希腊文“给予生命”之义，创造了基因（gene）一词，并用这个术语代替孟德尔的“遗传因子”。不过他所说的基因并不代表物质实体，而是一种与细胞的任何可见形态结构毫无关系的抽象单位。因此，那时所指的基因只是遗传性状的符号，还没有具体涉及基因的物质概念。约翰逊发现了连锁与交换律，并提出了基因在染色体上呈直线排列的理论（基因论）。一条染色体决定一个性状。一条染色体决定一个性状摩尔根（ThomasHuntMorgan，1866－1945）Griffith

首先用实验证基因的化学本质

就是DNA的是美国微生物学家O.T.Avery肺炎链球菌S毒、R无毒1944年在遗传学上树立了全新的观点-DNA是遗传信息的载体。Hershey和Chase再一次验证avery的结论，证明遗传物质是核酸而不是蛋白质1952年，Hershey和Chase以32P标记DNA，以35S标记蛋白质外鞘，发现大肠杆菌内控制其生理活动的因子为DNA，由此证明了噬菌体的遗传物质是DNA，从而进一步证实了，DNA是具有连续性的遗传物质。1956年，科学家Gierer和Schramm将烟草花叶病毒的蛋白质和RNA提取出来，分别涂抹在健康的烟草叶子上，结果只有涂抹RNA的叶片得病，而涂抹蛋白质的叶片不得病，这就证明了在没有DNA的病毒中，RNA是遗传物质。由此可见，DNA是生物的主要遗传物质，而在缺少DNA的生物中，RNA是遗传物质。2.2DNA的结构与功能结构复制传递遗传信息指导蛋白质的合成

英国生物物理学家阿斯特伯里爱尔兰科学家威尔金斯英国女科学家罗沙琳德·弗兰克林DNA双螺旋结构发现美国化学家鲍林从1951年起就在用同样的X射线晶体衍射方法研究蛋白质的氨基酸和多肽链，最后发现了血红蛋白多肽链为α螺旋链，他成为X射线晶体衍射的权威。1953年，最伟大的模型——DNA双螺旋结构模型被提出来了，两位创立者是美国生物化学家沃森和英国生物物理学家克拉克Watson和Crick

1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋模型，从此人们对基因就有了准确的物质内容的认识。DNA的一级结构DNA的一组结构，就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。核苷酸的化学组成核苷核苷酸DNA的二级结构DNA的高级结构在发现DNA双螺旋结构同时，Watson和Crick就提出DNA复制的可能模型。其后在1956年A.Kornbery首先发现DNA聚合酶；1958年Meselson及Stahl用同位素标记和超速离心分离实验为DNA半保留模型提出了证明；1968年Okazaki（冈畸）提出DNA不连续复制模型；1972年证实了DNA复制开始需要RNA作为引物；70年代初获得DNA拓扑异构酶，并对真核DNA聚合酶特性做了分析研究；这些都逐渐完善了对DNA复制机理的认识。

DNA的半保留复制如何标记ＤＮＡ分子？他们先将大肠杆菌细胞培养在用15NH4Cl作为唯一氮源的培养液里养很长时间（14代），使得细胞内所有的氮原子都以15N的形式存在（包括DNA分子里的氮原子）。这时再加入大大过量的14NH4Cl和各种14N的核苷酸分子，细菌从此开始摄入14N，因此所有既存的“老”DNA分子部分都应该是15N标记的，而新生的DNA则应该是未标记的。接下来他们让细胞们继续高高兴兴地生长，而自己则在在不同时间提取出DNA分子,利用CsCl密度梯度离心分离。对中心法则的补充发现RNA病毒RNA到DNARNA复制1961年，美国生物学家尼伦伯格等人成功破译了遗传密码，以无可辩驳的科学依据证实了DNA双螺旋结构的正确性。遗传密码-三联子1、以均聚物、随机共聚物和特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成2、核糖体结合技术3、研究烟草坏死卫星病毒发现，其外壳蛋白亚基由400个氨基酸组成，相应的RNA片段长1200个核苷酸，与密码三联子体系正好相吻合4、用吖啶类试剂（诱导核苷酸插入或丢失）处理T4噬菌体rII位点上的两个基因，使之发生移码突变（frame-shift），就生成完全不同的、没有功能的蛋白质2.3基因工程诞生的技术突破1.限制性内切酶（restrictionenzymes）1970年H.O.Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。WernerArber理论预见限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片断HamiltonO.Smith得到第一个限制酶1978年Nobel生理或医学奖2.DNA连接酶（ligase）1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。3.载体（vector）1972年前后使用小分子量的细菌质粒和

噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。4.感受态体系1970年M.Mandel和A.Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S.Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。5.琼脂糖凝胶电泳1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。6.DNA测序技术1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert发明了DNA快速测序技术。1980年Nobel化学奖2.4基因工程的诞生1980年Nobel化学奖1972年斯坦福大学的PaulBerg小组完成了首次体外重组实验：2.4.1.Berg的开创性实验将SV40的DNA片断与

噬菌体的DNA片断连接起来。（用DNA末端转移酶，而非限制性内切酶）2.4.2.Boyer-Cohen实验1973年斯坦福大学的S.Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。Boyer-Cohen实验StanleyCohen1986Nobel生理或医学奖HerbBoyer外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。3.1跨物种性3.2无性扩增外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。3基因工程的特征4.2重组体的制备4基因工程的主要操作内容4.1目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.4.克隆鉴定4.3.重组体的转化挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。4.5.目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。5.1对环境的影响5.2新型病毒的出现重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。5.基因工程的安全隐患将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。5.4.人造生物扩散新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。5.3癌症扩散6.1.公众的担忧6重组DNA研究的安全准则1973年美国的公众第一次公开表示担心应用重组DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。1974年美国国立卫生研究院（NIH）考虑到重组DNA的潜在危险，提请PaulBerg博士组成一个重组DNA咨询委员会。这个由11名分子生物学和重组DNA权威学者组成的委员会在同年7月发表公开信（science,158,303)，要求在没有弄清楚重组DNA所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒）。6.2.专家的态度6.3.制定安全规则1976年6月23日，NIH正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。规定了安全防护（物理防护和生物防护）标准以及禁止若干类型的实验。1979年、1981年、1989年NIH又做了多次修改，放宽了许多限制。分4级：P1—P4级。（1）实验室的物理安全6.4.基因工程的安全措施一般装备良好的普通微生物实验室。①P1级实验室②P2级实验室在P1级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜。全负压的实验室，同时装备安全操作柜。④P4级实验室专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。具有最高安全防护措施。③P3级实验室在自然环境中无法存活。（2）实验室的生物安全分3级（大肠杆菌）：EK1—EK3级。①EK1级的大肠杆菌在自然环境中一般都要死亡。②EK2-EK3级大肠杆菌第一个“安全”菌株是K12（1976年），很不实用，已淘汰。（3）

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