第五章 目的基因的获取 3

目的基因的获取基因工程的基本程序切PCR接转扩增开展基因工程首先必须获得基因，因此有特定的功能基因分离和克隆是重组DNA技术中基本和重要的组成部分。为了体外高效表达特定的生物活性蛋白，首先要分离和克隆相应的基因，这种基因常称为目的基因。因目的基因片断需插入载体，导入宿主细胞内进行复制或表达，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因或外源性DNA。

目的基因的用途

研究该基因的全貌和内涵,如详细分析基因结构、功能及调控；用正常的目的基因与异常基因分析对比，寻找其异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机制及治疗策略；研究生物种系进化与相关同源性；采用基因重组技术，使目的基因在体外获得高效表达，生产所需要的生物活性蛋白及多肽（如干扰素、胰岛素等药物）；通过基因突变、缺失或拼接改造某种目的基因，以改良品种，生产新型的生物活性物质，促经济发展；建立基因治疗，如选用和克隆某种正常基因，引入患者细胞内，以对某些遗传病、肿瘤等疑难疾病进行基因治疗。目的基因的获得1．人工化学合成法2．PCR法3．文库筛选法4．转座子标签法5．mRNA差别显示技术6．生物信息技术分离和鉴定目的基因1．人工化学合成法1.要求：1）已知目的基因的核苷酸序列或其对应的多肽链氨基酸序列2）较短的DNA片段，有专一性和定向性2.仪器：自动化DNA合成仪3.原理：第一个核苷酸固定于不溶性的固相载体上,然后按预定顺序从该核苷酸开始，以3’、5’-磷酸二酯键与另一核苷酸进行缩合反应（封闭非反应基团），其后用洗涤法除去多余的反应物和副产物,再用同样的步骤与下一个核苷酸进行缩合反应,如此循环将合成的寡核苷酸链从载体上洗脱下来,解除保护基,进一步纯化。应用范围：1）合成PCR引物2）寡核苷酸探针3）人工接头4）合成较小的基因合成基因时，要注意使用不同物种的偏爱密码子.1972年Khorana等首先用化学合成法合成了相当于酵母丙氨酸tRNA结构基因的DNA双链1979年合成了包括启动调节顺序在内,长207bp的大肠杆菌酪氨酸校正tRNA基因而后人们又相继合成了生长激素释放抑制因子、胰岛素、生长激素、α和γ干扰素、舒缓激肽、脑啡肽等基因，2.

PCR法分离目的基因（1）序列已知情况（2）序列未知情况（1）根据已知序列，采用PCR分离目的基因①已知序列是DNA片段例如：番茄defenderagainstapoptoticcelldeath（LeDAD1）序列LeDAD1序列（1）根据已知序列，采用PCR分离目的基因已知序列是mRNAmRNA：首先要分离（或纯化）mRNAA:根据mRNA序列直接设计引物；B:根据mRNA序列设计一条引物和OligoT/A引物进行PCR扩增

C:逆转录，以获得的cDNA为模板，进行PCR扩增。（2）序列未知，采用PCR分离目的基因①序列在其他物种上已有报道：例如：扩增杨树PDS基因PDS基因目前已在拟南芥、番茄、甜橙等植物上有报道具体做法：

首先找出上述几个物种的PDS基因序列，进行比对；寻找出其保守序列，根据保守序列设计引物（或简并引物）PCR扩增（DNA或RNA为模板）见PDS基因设计文档②已知部分序列，但不完全，可采取：反向PCR法（有时也称做染色体步移法）：RACE（RapidAmplificationofcDNAEnds）技术可分为5’-RACE和3’-RACE5’-RACE的原理是先是利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30作为锁定引物在反转录酶MMLV（或AMV）作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为上游引物，用一个基因特异引物2作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5‘末端的cDNA片段扩增出来5’RACE原理5’RACE原理利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3‘末端的DNA片段扩增出来。

3’RACE原理3’RACE原理序列在其他物种上也未见报道：采取其他方式获取目的基因，如文库构建等方式。3．文库筛选法（1）.cDNA基因文库（2）.基因组DNA文库cDNA基因文库cDNAlibrariescDNA基因文库

cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的cDNA片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各种mRNA的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的cDNA文库。cDNA文库没有原核生物的cDNA文库原核生物的mRNA非常不稳定；原核生物的基因组文库比较容易构建，能包含所有基因的序列。cDNA文库对于真核生物的基因分析cDNA文库是只含有编码蛋白的基因文库cDNAs

没有内含子基因可以在E.coli

中直接表达用于新基因的鉴别组织或特殊类型细胞（基因的特异表达）cDNA文库

mRNAisolation,purificationChecktheRNAintegrity

FractionateandenrichmRNA

SynthesisofcDNA

TreatmentofcDNAends

LigationtovectorcDNAlibrariescDNA文库-mRNA分离

大部分真核生物的mRNAs有3’poly（A）尾巴

oligo(dT)能与poly(A)尾巴互补，由此来获得mRNA.AAAAAAAAAAn5’cap1.传统的分离方法是用oligo(dT)-纤维素柱分离总RNA2.把oligo(dT)-磁珠同总RNA混合，在强磁场下分离mRNA3.用蔗糖梯度离心mRNA核糖体复合体（溶解细胞）来分离mRNA三种分离纯化mRNA的方法用纤维素纯化poly(A)mRNA的流程图确定mRNA没被降解

方法:mRNA的翻译:用体外蛋白质合成检测mRNAs。（麦胚无细胞转译体系或兔网织细胞裂解物转译体系）通过凝胶电泳分析mRNAs:用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳cDNA文库-检测mRNA的完整性cDNA的合成:第一链的合成:

mRNA,反转录酶，oligo(dT)，核酸末端转移酶，dNTPs1.oligo(dT)引导的cDNA合成法2.随机引物引导的cDNA合成法第二链的合成:

根据在第一链3’-末端加尾（C），用补充引物合成第二链

5’mRNA

AAAAA-3’HO-TTTTTP-5’5’ReversetranscriptaseFourdNTPsAAAAA-3’TTTTTP-5’mRNA

mRNA

cDNAcDNAcDNADuplexcDNAAAAAACCC-3’TTTTTP-5’TTTTTP-5’3’3’-CCCCCCCTerminaltransferasedCTPAlkali(hydrolyaesRNA)PurifyDNAoligo(dG)Klenowpolymerase5’-pGGGG-OH5’3’-CCCCCCC5’-pGGGG3’-CCCCCCCTTTTTP-5’-3’Thefirststrandsynthesis5’-pGGGG3’-CCCCCCCHO-CCGAATTCGGGGGG3’-GGCTTAAGCCCCCC5’-pAATTCGGGGGGTTTTTGGCTTAAGCC-OHCCGAATTCGG-3’3’-CCCC3’-CCCCCCC3’-CCCC5’-pGGGG5’-pGGGGTTTTTp-5’-3’TTTTTp-5’TTTTTp-5’-3’-3’TTTTTGGCTTAAp-5’HO-CCG/AATTCGG-3’3’-GGCTTAA/GCC-OHCCG-3’DuplexcDNASinglestrand-specificnucleaseKlenowpolymerasetreatwithE.coRImethylaseAddE.colRIlinkers

usingT4DNAligaseEcoRIdigestionLigatetovectorandtransfomSecondstrandsynthesis对cDNA末端的处理平末端的片断需要加入特殊的核苷酸序列形成粘性末端，才能进行克隆步骤:移去突出的3’-ends(strand-specialnuclease)填充缺失3’核苷酸(klenowfragmentofDNApolyIand4dNTPs)衔接物和平末端的连接(T4DNAligase)限制性内切酶的消化(E.coRI)与载体的连接

任何一个含有EcoRI酶切位点的载体都可以用来克隆cDNA.步骤:载体末端脱磷酸（碱性磷酸酶）用T4DNA连接酶连接载体和cDNA(plasmidorlphagevector)cDNA文库的优越性1.以mRNA为材料；

（一些RNA病毒，不经过DNA中间体，对其研究，cDNA是唯一可行的方法）2.文库的筛选比较简单易行；3.由于每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，在选择中出现假阳性的几率比较低；4.克隆在细菌中表达的基因，用作基因序列的测定，和发育过程中或组织中基因特异表达

基因组DNA克隆

Genomiclibraries基因组文库的构建

基因组文库（genomicDNAlibrary）：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片段随机地连接在载体上，然后转移到适当的宿主细胞中通过细胞增殖而构成各个片段的克隆。当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就称为某种生物的基因文库。同一定义也适用于线粒体或叶绿体ＤＮＡ的基因文库。由于制备ＤＮＡ片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的ＤＮＡ片段即可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近ＤＮＡ顺序。

基因文库的构建就是利用所谓的“鸟枪法”，使基因组的DNA片段随机地插入适当的载体中，引入细胞进行大量繁殖而构建的。基因组DNA文库纯化基因组DNA

基因组DNA的片断化物理切割和限制性内切酶eukaryotesprokaryotes与载体连接构建基因文库的基因组DNA必须进行纯化后，才能用来制备适用于载体插入片断大小的随机片断基因组DNA的纯化:

原核生物:直接从细胞中体取基因组DNA去除蛋白（蛋白酶消化）,脂类和其它“杂质”。真核生物

:从细胞核中Hae：5’-

…GG

/CC…

3’,Sau3A:5’-/GATC-3’,

Alu:5’-

…AG/CT…3’,BamH1:5’-G/GATCC限制性内切酶消化将片断的末端(粘性或平头)和酶消化的载体连接酶切位点是否被修饰内切酶消化的时间和用量取决于要插入片断的大小范围。

Lambda/HindIII:23130,9416,6557,4361,2322,2027,564,125

用于构建基因文库片段的产生大致有两种方法：一是用限制性内切酶完全消化基因组DNA，这个方法有两个特点。第一是假如所需的基因含有所用限制酶的识别位点，那么这一基因将被克隆在两个或数个片段中，给研究带来一定的困难。第二，一般常用的限制酶大多识别六个bp序列，切割DNA所产生的片段的平均大小相对比较小（约4kb即46＝4096bp），因此整个基因文库要含有非常大量的重组体，这样应用分子杂交法进行筛选就十分费事费时。虽然可以用限制酶进行部分消化，产生约20kb的片段，但这种方法必须掌握好酶解的条件。用于制备基因文库的随机片段的另一种方法是采用机械随机切割。这种方法可以制备大片段的DNA（用噬菌体λ作载体约20kb，以cosmid作载体约45kb），从而克服上述的两处缺点。但是这种方法的不是之处是：所制备的片段的末端顺序是随机的，还必须经过末端修复，人工制造接头等手续才能与载体ＤＮＡ进行连接。用于基因文库构建的载体常用噬菌体λ或cosmid载体，因为它们的容量比较大，可克隆大片段的DNA。虽然cosmid载体比λ载体的容量大，但由于文库的保存λ比cosmid容易，因此λ载体用的更多些。Hae

、Alu文库的大小(确定有足够的克隆数)必须包括一定数量的重组子才可能克隆基因组中的任何碱基序列。计算重组子数量的公式：N=ln(1-P)ln(1-f)P:重组体群体中出现目的基因的序列的几率（一般期望99%）f:限制片断的平均大小与基因组DNA总量之比N：一个完整基因文库所应包含的重组DNA的转化子的克隆数Forexample:期望值为0.99，插入片断为20kb的

E.coli(4.6×106bp)和human(3×109bp)基因组的克隆数的计算N

E.coli==1.1×103ln(1-0.99)ln[1-(2×104/4.6×106)]Nhuman==6.9×105

ln(1-0.99)ln[1-(2×104/3×109)]这个例子说明用质粒载体（插入片断5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则需要更大承载能力的载体。有一些序列不能被克隆 Example:1.序列缺乏酶切位点;2.目的基因包容在一个其大小范围超出载体承载能力的DNA片断上

Toolongforthevectorused载体根据基因组的大小选择合适的载体构建DNA文库。载体

PlasmidphageλcosmidBACYAC

插入片断

(kb)523453501000最常用的载体是phageλ文库构建的载体与宿主

质粒+大肠杆菌

λDNA+噬菌体其它:粘粒+大肠杆菌穿梭粘粒+大肠杆菌/酵母

YAC+酵母

BAC+大肠杆菌

TAC+大肠杆菌/农杆菌基因组DNA文库构建实例DNA的提取DNA的纯化,推荐CsCl密度梯度离心纯化DNA的部分酶切

采用Sau3AⅠ(5’···^GATC···3’);完全酶切会产生相当小的片段部分酶切会产生大小不一的片段,通过加入不同量的酶来控制部分酶切的程度部分酶切的目的:获得尽可能多的长度在15-23kb之间的片段DNA片段的部分补平Sau3AⅠ酶切产生5’突出未端(4个碱基)应用Klenow片段的聚合作用以dGTP,dATP为底物突出未端被部分补平,留下突出2个碱基的5’突出未端经部分补平的DNA片段不再相互自连载体DNA的充分酶切和部分补平采用XhoⅠ充分酶切,留下5’突出未端(突出4个碱基)LambdaDNA经酶切产生左臂(20kb),中间插入片段(14kb)和右臂(9kb)三个片段应用Klenow片段的聚合作用以dTTP,dCTP为底物突出未端被部分补平,留下突出2个碱基的5’突出未端经部分补平的载体DNA片段间不再相互自连部分补平的载体DNA与部分补平的酶切片段连接重组λDNA的包装(packaging)

噬菌体由λDNA和蛋白质外壳组成,离体条件下连接产生的重组λDNA可与商业公司提供的包装蛋白组装成有活性的噬菌体(phage)重组λDNA与包装蛋白在22℃共保温3h即完成包装所有大小的DNA片段均可成功与载体连接,但只有大小居于15-23kb之间的片段与载体连接后方可包装成有繁殖能力的噬菌体滴度测定(titering)

噬菌体溶液与大肠杆菌(LE392或KW251)溶液混和,37℃保温30min后与45℃的Topagarose混和,铺于LB平板上培养数小时至过夜后会出现噬菌斑,每个斑对应于原先的一个噬菌体粒子文库的效率以初始1μg基因组DNA所形成的噬菌斑数计算,单位为pfu/μgpfu:phagef