分子生物学检验技术第8章

第八章

核酸分子杂交技术武汉大学郑芳第八章

核酸分子杂交技术第二节探针的设计与标记第三节分子杂交第四节核酸分子杂交技术的应用

第一节

核酸杂交的基本原理与分类第一节

核酸杂交基本原理与分类

第一节

核酸杂交的基本原理与分类

二、杂交的基本分类一、核酸分子杂交的基本原理第一节

核酸杂交的基本原理与分类

单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称核酸分子杂交利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术变性复性一、核酸分子杂交的基本原理DNA加热变性DNA冷却复性DNA/RNA杂交一、核酸分子杂交的基本原理二、杂交的基本分类

（一）液相杂交（二）固相杂交（三）原位杂交（四）基因芯片技术点杂交/狭缝杂交菌落杂交Northern杂交Southern杂交MASA液态芯片MASA技术的原理是用不同的荧光颜色对乳胶颗粒进行编码使之具有检测多个靶分子的能力二、杂交的基本分类二、杂交的基本分类二、杂交的基本分类二、杂交的基本分类二、杂交的基本分类二、杂交的基本分类二、杂交的基本分类2.Southernblot3.Northernblot4.点杂交和狭缝杂交5.荧光原位杂交6.基因芯片1.菌落杂交1.菌落杂交二、杂交的基本分类DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳分离膜上固定DNA片段在缓冲液中将标记的探针加到膜上DNA片段从琼脂糖凝胶上转印到膜上杂交信号的检测2.Southernblot3.Northern印迹杂交二、杂交的基本分类4.点杂交和狭缝杂交

DNA样品点到滤膜上1变性2中和3固定DNA4与标记探针杂交5洗脱与显影探针DNA探针标记

变性将探针加到固定的DNA上二、杂交的基本分类5.荧光原位杂交二、杂交的基本分类6.基因芯片二、杂交的基本分类第二节探针的设计与标记

第二节探针的设计与标记

（二）标记方法（一）探针种类的选择（一）探针种类的选择DNA探针RNA探针寡核苷酸探针一、设计原理一、设计原理

（二）标记方法1.探针标记物的选择放射性标记非放射性标记

一、设计原理

2.探针标记方法的选择随机引物标记DNA缺口平移标记全程RNA探针标记化学法全程标记3′末端标记5′末端标记一、设计原理

随机引物标记DNA模板引物和模板DNA结合加入klenow片断、3种dNTP和1种标记dNTP引物延伸一、设计原理DNaseⅠDNA聚合酶Ⅰ（5’－3’核酸外切酶活性）DNA聚合酶Ⅰ（5’－3’核酸外切酶活性5’－3’聚合酶活性）＋3dNTP＋1dNTP#DNaseⅠDNA聚合酶Ⅰ（5’－3’核酸外切酶活性5’－3’聚合酶活性）模板DNA切开模板DNA形成一到几个碱基的缺口掺入标记基团缺口平移DNA缺口平移标记一、设计原理在△处酶切在◆处酶切从T7启动子转录从SP6启动子转录全程RNA探针标记一、设计原理

化学法全程标记

与地高辛标记的探针杂交加入与碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体加入底物BCIP/NBTCSPD一、设计原理末端标记3’-末端标记5’3’3’5’5’末端突出的DNA5’5’3’3’3’末端标记的DNA完整双链DNAKlenowDNA聚合酶32p—dNTP变性32p末端标记的单链DNA探针第三节分子杂交一、核酸分子与固相介质的结合第三节分子杂交二、杂交三、信号检测紫外交联仪进行核酸固定第三节