第三章 核酸的结构与功能

北京师范大学

生物化学科目冲刺班第三章核酸的结构与功能Introductionofnucleicacid核酸的发现和研究简史核酸的种类和分布核酸的生物功能核酸通论核酸通论1944年，O.N.Avery通过转化实验证实DNA是主要的遗传物质肺炎双球菌转化实验核酸通论肺炎双球菌转化实验1952，A.DHershey和M.Chase噬菌体感染实验核酸通论核酸通论噬菌体感染实验核酸通论1953年，JamesWatson&FrancisCrick提出DNA双螺旋结构模型2.0nm核酸通论1958年，Crick提出遗传信息传递的中心法则二、核酸的种类和分布核酸通论脱氧核糖核酸（DNA）核糖核酸（RNA）核酸（nucleicacid）DNA与RNA的区别核酸通论核酸碱基组成核糖类型结构主要功能DNAATGC脱氧核糖多为双链携带与传递遗传信息RNAAUGC核糖多为单链参与遗传信息的表达（一）脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）原核：环状双链分子，集中于核区，包括染色体DNA与质粒DNA真核：细胞核DNA－线型双链分子，与组蛋白等形成染色体细胞器DNA－环状双链分子，一般裸露病毒：类型多样（环状双链、线型双链、线型单链、环状单链）核酸通论（二）核糖核酸（ribonucleicacid,RNA)1、转移RNA（transferRNA,tRNA)2、核糖体RNA（ribosomalRNA,rRNA)3、信使RNA（mesengerRNA,mRNA)4、特殊功能的RNAsnRNA,snoRNA,scRNA，AntisenseRNA，Ribozyme5、病毒RNA核酸通论核酸通论三、核酸的功能（一）DNA是主要的遗传物质间接证据：DNA是染色体的主要成分DNA含量十分稳定，与染色体数目平行可作用于DNA的理化因素可引起遗传性状的改变。。。。。。。。。。。。核酸通论直接证据：核酸通论肺炎双球菌转化实验噬菌体感染实验DNA双螺旋结构模型基因与基因组遗传学概念：基因指在染色体上占有一定位置的遗传单位。基因的三个属性可通过复制将遗传信息由亲代传递给子代经转录对表型有一定的效应可突变形成各种等位基因DNA的研究表明，基因就是DNA的一个片段。基因即DNA上一段有特点功能的核苷酸序列，通常被认为是遗传物质的最小功能单位。核酸通论基因与基因组基因组是生物体内遗传信息的集合，是某个特定物种细胞内全部DNA分子的总和。原核生物基因组与真核生物基因组各有特色。人类基因组（humangenome）包括24条染色体，约30亿对核苷酸，5－6万个基因，携带了人类个体生长发育、生老病死的全部遗传信息。人类基因组中，仅有1%的基因组DNA直接编码蛋白质。核酸通论（二）RNA功能的多样性1、参与和控制蛋白质的合成核酸通论2、作用于RNA的转录后加工与修饰3、参与基因表达与细胞功能的调节4、生物催化作用与其他细胞持家功能5、遗传信息的加工与进化核酸通论第一节核酸的组成核酸的结构组成核酸的基本元素：C、H、O、N、P；其中P的含量比较稳定，占9%-10%，可以通过测定P的含量来推算核酸的含量；

DNA平均含磷量为9.9%，RNA为9.4%。核酸的元素组成核酸（nucleicacid）核苷酸（nucleotide）磷酸（phosphoricacid）核苷（nucleoside）戊糖（pentose）碱基（base）核酸的化学组成核酸的结构核酸核糖核苷酸（ribonucleotide）脱氧核糖核酸（DNA）脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide）核酸的结构核糖核酸（RNA）两类核酸的基本化学组成RNADNA组成戊糖核糖（D-ribose）脱氧核糖（D-2-deoxyribose）碱基腺嘌呤（adenine）、鸟嘌呤（guanine）、胞嘧啶（cytosine）、尿嘧啶（uracil）腺嘌呤（adenine）、鸟嘌呤（guanine）、胞嘧啶（cytosine）、胸腺嘧啶（thymine）磷酸phosphoricacidphosphoricacid核酸的结构一、

核苷酸核酸的结构核苷酸（nucleotide）磷酸＋核糖＋碱基核糖核苷酸（ribonucleotide）脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide）磷酸＋脱氧核糖＋碱基核苷酸的基本结构核酸的结构（一）碱基1.嘧啶碱：尿嘧啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶2.嘌呤碱：腺嘌呤、鸟嘌呤3.稀有碱基：近百种，多数是甲基化的产物核酸的结构核酸的结构嘧啶碱核酸的结构嘌呤碱核酸的结构(二)核苷（nucleoside）核苷＝戊糖＋碱基核糖

核糖核苷脱氧核糖

脱氧核糖核苷

OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12β-D-2-核糖β-D-2-脱氧核糖O核酸的结构糖与碱基之间的C-N键称为N－糖苷键嘧啶核苷嘌呤核苷1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)核酸的结构该糖苷键为－糖苷键碱基与糖环平面互相垂直（三）核苷酸核苷酸＝核苷+磷酸（核苷酸是核苷的磷酸酯）核苷中戊糖C2、C3、C5羟基可被磷酸酯化（脱氧核糖只有两个羟基可被磷酸酯化）核酸的结构构成DNA的核苷酸：5’－脱氧核苷酸核酸的结构构成RNA的核苷酸：5’－核苷酸核酸的结构细胞内的游离核苷酸及其衍生物①核苷5’-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用核酸的结构AMPADPATP②环核苷酸核酸的结构3’,5’-cAMP3’,5’-cGMP3'5'1'cAMP作为信号分子，参与调节细胞的糖代谢、脂代谢。核酸的结构③核苷5’多磷酸3’多磷酸化合物ppGpp、pppGpp、ppApp④核苷酸衍生物HSCoA、NAD+、NADP+、FAD等是酶的辅因子。GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供体。核酸的结构核酸的结构核酸的结构二、核酸的共价结构核酸是核苷酸聚合成的生物大分子，无分支结构。核酸的共价结构就是核酸的一级结构，通常指核酸的核苷酸序列。核酸的结构（一）核酸中核苷酸的连接方式核苷酸是核酸的结构单位；核酸的结构核酸中的核苷酸以磷酸二酯键彼此相连；核酸的结构U5'5'OHOHOHOHOH3'3'2'2'5'蛇毒磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶XYDNA与RNA均以3',5'-磷酸二酯键连接核苷酸。核酸的结构核酸的结构DNARNA5′PdAPdCPdGPdTOH3′5′PAPCPGPUOH3′5′ACGT3′5′ACGU3′

ACGTACGU若不特别注明，一般规定从5'端书写至3'端核酸的结构T5’3’OHU5’3’OHOHOHOHOH竖线式文字式核酸一级结构的表示方法（二）DNA的一级结构

DNA是dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通过3’,5’-磷酸二酯键连接起来的线形或环形多聚体，没有分支。核酸的结构核酸的结构脱氧核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接起来，以磷酸-糖-磷酸-糖…形成核酸骨架5’5’3’3’DNA一级结构的特点无分支的线形或环形链；DNA链很长，分子量很大，编码巨大的信息量；真核生物与原核生物具有不同的特性：真核生物具有断裂基因，有内含子，无操纵子，调控序列所占比例大，有大量重复序列。。。。。。原核生物无内含子，有操纵子，调控序列所占比例小，很少重复序列。。。。。核酸的结构RNA一级结构的特点无分支的线形链；核酸的结构RNA种类核苷酸数目碱基组成3'端5'端其他特点tRNA73-93稀有碱基较多CpCpAOHpG或pC有保守序列5SrRNA120无稀有碱基5.8SrRNA160有修饰碱基核糖可被甲基化原核mRNA以操纵子作为转录单位无修饰碱基有一段非翻译区有一段非翻译区有多顺反子mRNA真核mRNA/有修饰碱基有poly(A)有5'端帽子单顺反子不同种类具有不同结构：核糖体RNA核酸的结构单顺反子与多顺反子核酸的结构原核生物mRNA的一级结构核酸的结构5´3´顺反子顺反子顺反子插入顺序插入顺序先导区末端顺序真核生物mRNA的一级结构核酸的结构AAAAAAA-OH5´

“帽子”PolyA

3´

编码区m7G-5´ppp-N-3´p非编码区非编码区真核生物mRNA的5'帽子核酸的结构真核生物mRNA的5'帽子帽子结构通常有三种类型：O型（m7G5'ppp5'Np）I型（m7G5'ppp5'NmpNp）II型（m7G5'ppp5'NmpNmpNp）帽子结构的功能：抗5'核酸外切酶的降解作用有助于蛋白质合成过程中核糖体对mRNA的识别与结合，使翻译得以正确起始核酸的结构三、DNA的结构一级结构：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。二级结构：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。三级结构：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。核酸的结构（一）DNA的二级结构核酸的结构1953年，Watson和Crick根据Chargaff规律和DNA钠盐纤维的X光衍射结果提出了DNA的双螺旋结构模型。2、Watson-Crick双螺旋结构模型核酸的结构两条反向平行（一条5’→3’，另一条3’→5’）的多核苷酸链绕同一中心轴相互缠绕，形成右手双股螺旋。核酸的结构嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，彼此通过3’,5’-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。碱基平面与纵轴垂直，糖环的平面与纵轴平行。核酸的结构2.0nm小沟大沟两条链配对偏向一侧，形成一条大沟和一条小沟。大沟：宽1.2nm，深0.85nm小沟：宽0.6nm，深0.75nm核酸的结构基本数据：2.0nm小沟大沟平均直径2nm碱基堆积距离0.34nm相邻核苷酸夹角36o螺距3.4nm核酸的结构两条链依靠碱基之间形成的氢键结合在一起。碱基配对原则：A－TG－C核酸的结构核酸的结构碱基在一条链上的排列顺序不受任何影响；但是根据碱基配对原则，当一条链的序列被确定后，即可决定另一条互补链的序列。3、稳定双螺旋结构的因素①碱基堆积力（主要因素）核酸的结构②碱基配对的氢键。GC含量越多，DNA结构越稳定。核酸的结构③磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。④碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。核酸的结构4、双螺旋结构的意义核酸的结构5、

DNA二级结构的多形性核酸的结构B－DNA：典型的Watson-Crick双螺旋DNA，水分含量高，接近大部分DNA在细胞中的构象；A－DNA：相对湿度75％以下获得的DNA纤维的二级结构；Z－DNA：左手螺旋，见于人工合成的d(CGCGCG)结构中，天然B-DNA的局部区域也可以形成Z-DNA。核酸的结构A、B、Z型DNA的主要区别核酸的结构

DNA的各型构象在一定条件下可以相互转变当DNA钠盐纤维相对湿度和盐的种类改变时，DNA的构象发生改变。类型结晶状态ANa盐，相对湿度75%时结晶BNa盐，相对湿度92%时结晶C锂盐，相对湿度66%时结晶

DNA的变构效应可能与基因表达的调节有关。(二）DNA的三级结构DNA在双螺旋的基础上通过扭曲和折叠形成的构象包括不同二级结构单元间的相互作用、单链与二级结构单元间的相互作用以及DNA的拓扑特征超螺旋是DNA三级结构的代表形式核酸的结构超螺旋当DNA双螺旋分子在溶液中以一定构象自由存在时，双螺旋处于能量最低的状态，称为松弛态核酸的结构如果使处于松弛态的DNA分子额外地多转或少转几圈，会使双螺旋中存在张力如双螺旋分子的末端是开放的，此张力可以通过链的转动释放出来，DNA恢复正常的双螺旋状态核酸的结构如DNA分子的两端是固定的，或者是环状分子，这种额外的张力不能释放，DNA分子本身会发生扭曲，用于抵消张力这种扭曲称为超螺旋，是双螺旋的螺旋核酸的结构ABA：少转2圈B：DNA分子扭曲1、环状DNA的三种典型构象松弛环状DNA

线形DNA直接环化解链环状DNA

线形DNA拧松后再环化超螺旋DNA核酸的结构核酸的结构松弛环状DNA超螺旋DNA解链环状DNA2、三种环状DNA的拓扑学特性核酸的结构①连环数（linkingnumber,L）DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数②扭转数（twistingnumber,T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目③超螺旋数（缠绕数,writhingnumber,W）核酸的结构连环数（L）扭转数（T）缠绕数（W）松驰环25250解链环23230超螺旋2325-2核酸的结构L=T+W核酸的结构环状DNA分子的拓扑异构体具有不同的L值拓扑异构酶可以改变L值：I类酶每催化一次，L值增加1；II类酶每催化一次，L值减少2I类拓扑异构酶II类拓扑异构酶④比连环差（specificlinkingdifference,λ）表示DNA的超螺旋程度（Superhelixdensity）λ=（L－L0）/L0，L0指松驰环形DNA的L值核酸的结构λ=（L－L0）/L0

＝(23-25)/25=-0.08核酸的结构超螺旋：正超螺旋，λ0；负超螺旋，λ

0左手螺旋右手螺旋核酸的结构3、超螺旋的功能负超螺旋易于解链，有利于于DNA的复制、重组和转录等过程的进行；生物体内可通过调节DNA的拓扑结构来调节其功能。核酸的结构（三）DNA与蛋白质复合物的结构（四级结构）核酸的结构病毒：类型多样（环状双链、线型双链、线型单链、环状单链）原核：环状双链分子，集中于核区，包括染色体DNA与质粒DNA真核：细胞核DNA－线型双链分子，与组蛋白等形成染色体细胞器DNA－环状双链分子，一般裸露核蛋白（nucleoprotein）1.病毒中的DNA病毒组成：核酸、蛋白、脂类、糖类基因组：单链或双链的DNA（或RNA），多数环状核酸的结构2.细菌染色体的结构

细菌基因组多数为双链环状DNA，与碱性蛋白、RNA结合，形成带有无数突环的刷状染色体，又称为拟核。核酸的结构核酸的结构3.真核生物染色体的结构（1）染色质与染色体染色质和染色体的主要成分都是DNA和蛋白质,它们是同一物质在细胞周期的间期和分裂期的不同表现形态。染色质出现于间期,在光镜下呈颗粒状,不均匀地分布于细胞核中,比较集中于核膜的内表面。染色体出现于分裂期中,呈较粗的柱状和杆状等不同形状,并有基本恒定的数目(因生物的种属不同而异)。染色体是由染色质浓集而成的,内部为紧密状态,呈高度螺旋卷曲的结构。核酸的结构核酸的结构（2）染色体与染色质的结构染色体的基本结构单位是核小体（nucleosome)核小体由一个组蛋白核心与盘绕其上的DNA双螺旋构成组蛋白核心由组蛋白H2A、H2B、H3、H4组成，为八聚体DNA以左手螺旋在组蛋白核心上盘绕1.8圈核酸的结构核小体之间通过连接DNA相连组蛋白H1结合于连接DNA上，使核小体彼此靠拢核酸的结构核酸的结构染色体DNA组装不同层次的结构染色体DNA组装不同层次的结构核酸的结构染色体DNA组装不同层次的结构核酸的结构核酸的结构（3）染色体与染色质结构的意义压缩DNA；保护DNA；调节基因的活性。。。。。。。。。。。。核酸的结构四、RNA的结构

RNA通常是单链线型分子

RNA可自身回折形成局部双螺旋（二级结构），并进一步折叠形成三级结构

RNA可与蛋白质形成核蛋白复合体（四级结构）核酸的结构维系RNA高级结构的氢键tRNA中的稀有碱基核酸的结构假尿嘧啶次黄嘌呤二氢尿嘧啶甲基鸟嘌呤三叶草形二级结构氨基酸臂二氢尿嘧啶环反密码环（anticodenloop）额外环

TψC环（假尿嘧啶环）核酸的结构核酸的结构核酸的结构

tRNA的三级结构：tRNA的二级结构进一步扭曲折叠形成一种形状象倒L型字母的三维结构。

核酸的结构核酸的结构维系三级结构的因素：氢键、碱基堆积力二氢尿嘧啶环中的某些碱基与TψC环及额外环中的某些碱基之间形成额外的碱基对。

在tRNA二级结构中未配对的某些并不互补的碱基参与了三级结构中特殊的氢键作用。

tRNA链中的核糖-磷酸骨架与某些碱基甚至其他的骨架之间也能产生作用。核酸的结构维系RNA高级结构的氢键核酸的结构维系三级结构的氢键核酸的结构

tRNA分子功能：转运氨基酸核酸的结构氨基酰－tRNA的生成核酸的结构氨基酰－tRNA的生成（二）rRNA的结构核酸的结构核糖体的结构：大亚基小亚基核酸的结构细菌：16SrRNA、5SrRNA、23SrRNA组成30S转录单位真核：18SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA组成45S的转录单位，5SrRNA单独转录。小亚基大亚基转录单位原核1652330真核185（单独转录）285.85+45核酸的结构45SrRNA的加工过程在rRNA聚合酶Ⅰ的作用下，将18SrRNA、5.8SrRNA和28SrRNA转录成45S的前体；然后通过一系列的切割加工形成成熟的18SrRNA、5.8SrRNA和28SrRNA；其中5.8S的rRNA通过互补碱基的氢键与28SrRNA结合在一起。核酸的结构核酸的结构E.coli核糖体结构模型：图中分别显示了小亚基、大亚基中一些核糖体蛋白质的位置，以及蛋白质合成过程中mRNA在核糖体中的位置。E.coli小亚基21种蛋白质的排列核酸的结构5srRNA的二级结构核酸的结构5srRNA的三级结构核酸的结构16srRNA的二级结构核酸的结构16srRNA的三级结构核酸的结构rRNA的结构与功能的关系核酸的结构23SrRNA的肽酰转移酶（peptidyltransferase）活性核酸的结构（三）其他RNA的高级结构

mRNA的高级结构核酶的高级结构核酸的结构核酸的结构basesequenceofthe3'endofanmRNAtranscriptinE.coli.锤头结构核酶与人工设计的核酶箭头表示剪切位点，粗线代表人工合成的RNA片段，细线代表欲破坏的目的核酸分子核酸的结构（三）RNA与蛋白质的复合结构核酸的结构T.thermophilus核糖体三、DNA的结构一级结构：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。二级结构：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。三级结构：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。核酸的结构核酸的结构四、RNA的结构

RNA通常是单链线型分子

RNA可自身回折形成局部双螺旋（二级结构），并进一步折叠形成三级结构

RNA可与蛋白质形成核蛋白复合体（四级结构）（三）DNA与蛋白质复合物的结构（四级结构）核酸的结构病毒：类型多样（环状双链、线型双链、线型单链、环状单链）原核：环状双链分子，集中于核区，包括染色体DNA与质粒DNA真核：细胞核DNA－线型双链分子，与组蛋白等形成染色体细胞器DNA－环状双链分子，一般裸露基本概念：染色体、染色质核小体（nucleosome)组蛋白核酸的结构染色体DNA组装不同层次的结构核酸的结构核酸的结构染色体结构的意义压缩DNA；保护DNA；调节基因的活性。。。。。。。。。。。。核酸的结构四、RNA的结构

RNA通常是单链线型分子

RNA可自身回折形成局部双螺旋（二级结构），并进一步折叠形成三级结构

RNA可与蛋白质形成核蛋白复合体（四级结构）核酸的结构核糖体：RNA＋蛋白核酸的结构习题比较DNA和RNA在化学结构上、大分子结构上和生物学功能上的异同点。简述DNA双螺旋结构的特点，这些特点能解释哪些基本的生命现象？在稳定的DNA双螺旋中，哪两种力在维系分子立体结构方面起主要作用？3.简述tRNA二级结构的组成特点及每一部分的功能。4.染色体与核糖体的结构如何体现核酸与蛋白的相互关系？核酸的水解核酸的酸碱性质核酸的紫外吸收核酸的变性和复性核酸的理化性质一、核酸的水解核酸的理化性质酸水解碱水解酶水解核酸的理化性质（一）酸水解对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸酯键嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键脱氧核糖＞核糖核酸的理化性质利用酸水解可以研究核酸的碱基组成：脱嘌呤：pH1.6，37℃，对水透析pH2.8，100℃，1h脱嘧啶：98-100%甲酸，175℃，2h三氟乙酸，155℃，60min（DNA）或80min（RNA）（二）碱水解RNA的磷酸酯键对碱敏感室温，0.3-1mol/LKOH，18-24h，可将RNA完全水解，得到2’-或3’-核苷酸的混合物。原理：核糖2'－羟基，磷酸三酯核苷2',3'环磷酸酯核酸的理化性质核酸的理化性质碱水解的机理DNA抗碱水解生理意义：DNA更稳定，传递遗传信息。RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。核酸的理化性质（三）酶水解非特异的磷酸二酯酶（phosphodiesterase）：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸特异的磷酸二酯酶：核酸酶（nuclease）N-糖苷酶核酸的理化性质1.核酸酶的分类底物专一性：核糖核酸酶（ribonuclease,RNase）脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease,DNase）作用方式：核酸外切酶（exonuclease)核酸内切酶(endonuclease)核酸的理化性质磷酸二酯键的断裂方式：产物为5’-磷酸（寡）核苷酸产物为3’-磷酸（寡）核苷酸其他分类标准单链酶、双链酶3'5'、5'3'

核酸的理化性质2.RNAase牛胰核糖核酸酶,RNaseI具有极高专一性的内切酶最适pH7.0-8.2，耐热作用位点：嘧啶核苷-3'-磷酸与其他核苷酸之间的连键产物：以3’-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸核酸的理化性质RNaseT1耐热、耐酸，专一性更高作用位点：3'-鸟苷酸与其他核苷酸之间的连键产物：以3’-鸟苷酸结尾的寡核苷酸RNaseT2作用位点：3'-腺苷酸与其他核苷酸之间的连键产物：以3’-腺苷酸结尾的寡核苷酸核酸的理化性质3.DNase牛胰脱氧核糖核酸酶，DNaseI切断双链或单链DNA产物：以5’-磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度4个核苷酸最适pH7－8，Mg2+（Mn2+，Co2+）依赖性牛脾脱氧核糖核酸酶，DNaseII产物：以3’-磷酸为末端的寡核苷酸，平均长度6个核苷酸最适pH4－5，Na+激活核酸的理化性质限制性内切酶：来自细菌中，可降解外源DNA作用底物－双链DNA具有严格的碱基序列专一性通常需要镁离子核酸的理化性质限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，构成一个限制修饰系统，甲基化酶使细菌自身的DNA带上标志，限制性内切酶专门用于降解入侵的外源DNA。核酸的研究限制性核酸内切酶类型核酸内切酶有I、II、III三种类型，其中II型酶在DNA克隆中十分有用。II型酶的特点：限制和修饰活性分开，蛋白质结构是单一成分，辅助因子镁离子，位点序列旋转对称（反向重复）。核酸的研究反向重复（invertedrepeats）也称回文结构（palindromicstructure）核酸的研究限制酶识别的序列长度和切割频率

限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基。核酸的研究序列长度切割频率444=256646=4096848=65536限制酶的命名：EcoRI第一位：属名E（大写）第二、三位：种名的头两个字母小写co第四位：菌株R第五位：从该细菌中分离出来的这一类酶的编号核酸的研究限制性图谱同一DNA用不同的限制酶进行切割，从而获得各种限制酶的切割位点，由此建立的位点图谱有助于对DNA的结构进行分析。核酸的研究二、核酸的酸碱性质碱基、核苷与核苷酸均能发生两性解离核酸的理化性质1、碱基的解离核酸的理化性质胞嘧啶的酸碱解离核酸的理化性质尿嘧啶的酸碱解离胸腺嘧啶的酸碱解离腺嘌呤的酸碱解离核酸的理化性质鸟嘌呤的酸碱解离核酸的理化性质2、核苷的解离核酸的理化性质戊糖影响了碱基的解离糖的存在增强了碱基的酸性解离，使pK1'下降核糖中的羟基也可以发生解离，pK1'通常大于123、核苷酸的解离核酸的理化性质磷酸基使核苷酸具有较强的酸性核酸的理化性质在多核苷酸中，磷酸二酯键中的磷酸基只有一个解离常数核酸的理化性质胞嘧啶核苷酸的解离方程式与等电点的计算核酸的理化性质4种核苷酸的解离曲线核酸的理化性质多核苷酸（核酸）等电点核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此核酸具有两性解离的性质。核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏低。

DNA的pI约为4～4.5，RNA的pI约为2.0～2.5。应用：离子交换层析、电泳。核酸的理化性质小牛胸腺DNA的滴定曲线I：正向滴定II：反向滴定4、核酸的滴定曲线碱酸I三、核酸的紫外吸收核酸的理化性质嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240－290nm的紫外波段有强烈的光吸收

λmax≈260nm核酸的理化性质五种核苷酸的紫外吸收光谱与摩尔吸光系数（260nm，pH7.0）紫外吸收光谱的应用鉴定纯度纯DNA的A260/A280应大于1.8纯RNA的A260/A280应达到2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。核酸的理化性质核酸的理化性质五种核苷酸与两种氨基酸的紫外吸收光谱比较含量计算核酸的理化性质纯样品A260=150g/ml双螺旋DNA20g/ml寡核苷酸40g/ml单链DNA/RNA判断DNA是否变性核酸的理化性质

(P)：摩尔磷吸光系数c：每升溶液中磷的摩尔数W：每升溶液中磷的重量（克）一般天然DNA的

(P)值约为6600RNA的

(P)值约为7700-7800核酸的

(P)值比核苷酸单体的

(P)低40%-45%核酸的理化性质单链多核苷酸的

(P)值比双螺旋结构多核苷酸的(P)值高：在DNA的变性过程中，

(P)值增大（增色效应，hyperchromiceffect）在DNA的复性过程中，

(P)值减小（减色效应，hypochromiceffect）原因：双螺旋结构使碱基对的电子云重叠，减少光吸收核酸的理化性质核酸的理化性质测定核酸的(P)值可用于判断DNA是否发生变性或降解核酸的理化性质红：天然DNA蓝：变性DNA绿：降解的DNA（核苷酸总吸光度）四、核酸的变性、复性及杂交核酸的理化性质(一)变性（denaturation）核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。变性因素热变性酸碱变性（pH小于4或大于11）化学变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）核酸的理化性质变性后理化性质的改变260nm吸光度值升高粘度降低，浮力密度升高比旋下降。。。。。。。核酸的理化性质

DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内，有一个相变的过程。熔解温度（Tm）：加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度。DNA的Tm一般在82－95℃之间。核酸的理化性质meltingtemperature影响DNA的Tm值的因素①DNA的均一性（homogeneity）均质DNA均一性高，熔解过程发生在较窄的温度范围以内异质DNA的熔解过程发生在较宽的温度范围以内

Tm值可作为分析DNA样品均一性的标准核酸的理化性质核酸的理化性质②G-C含量

G-C含量与Tm值成正比原因：G-C对之间有三个氢键应用：测定Tm，可推知G-C含量核酸的理化性质核酸的理化性质G-C含量与Tm值的关系曲线③介质中离子强度离子强度高，Tm高，熔解温度的范围窄应用：用含盐的缓冲液保存DNA样品核酸的理化性质核酸的理化性质补充：RNA的变性

RNA具有螺旋线团的转变，即变性过程

RNA的变性曲线比DNA更缓和，Tm较低

tRNA具有较多双螺旋区，Tm较高，曲线更陡双链RNA的变性几乎与DNA相同核酸的理化性质(二)复性核酸的理化性质变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性后，一系列物化性质将得到恢复，生物活性可得到部分的恢复。核酸的理化性质DNA的复性核酸的理化性质影响DNA复性的因素降温速率，负效应（热变性的DNA在缓慢冷却的条件下可以复性，称为退火－annealing）DNA片段大小，负效应DNA浓度，正效应重复序列数目，正效应核酸的理化性质高于Tm值5℃复性也称退火or淬火(三)分子杂交（hybridization）核酸的理化性质在变性的DNA溶液中加入外源DNA单链分子或RNA单链分子（与原DNA具有序列互补性），去掉变性条件后复性形成双螺旋结构的过程。DNA与DNA形成的新分子称为杂交DNA分子。核酸的理化性质核酸的理化性质核酸的理化性质分子杂交的种类SouthernBlotting：检测DNANorthernBlotting：检测RNAWesternBlotting：检测抗原/抗体原位杂交：活体组织上进行杂交，显出荧光核酸的理化性质DNA样品酶切、电泳碱变性、转膜、固定放射自显影杂交、洗涤SouthernBlotting（1975，英国E.M.Southern首创）具体方案：酶切降解：限制性内切酶电泳：琼脂糖凝胶电泳变性：0.5mol/LNaOH转膜：硝酸纤维素膜（NC膜），尼龙膜固定：80℃，4-6h杂交：高盐浓度，68℃，几小时，探针核酸的理化性质核酸的理化性质探针（probe）：用于杂交的异源DNA或RNA序列，其核苷酸序列是人工特定的、已知的，经放射性标记（32P）的一条链。应用：DNA之间同源性分析确定特异性DNA序列的大小和定位钓单拷贝基因核酸的理化性质核酸的性质核酸的酸碱性质带电性质核酸的水解核酸的紫外吸收