第21章常用分子生物学技术的原理及其应用

常用分子生物学技术的原理及应用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第21章第一节分子杂交与印迹技术核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理：分子杂交与印迹技术的原理与应用；末端终止法测定DNA序列的原理；PCR(polymerrasechainreaction)技术原理；酵母双杂交技术的原理与应用；凝胶阻滞实验的原理与应用；染色质免疫沉淀实验的原理与应用；基因诊断与基因治疗。熟悉：探针、DNA点阵、DNA芯片、基因文库；转基因技术、基因靶向灭活、转基因动物与克隆动物；基因诊断常用技术；基因治疗的种类。了解：分子杂交技术的类别与应用；PCR技术的发展与类别；DNA自动测序技术；标签蛋白沉淀实验；基因增补的治疗程序；疾病相关基因的功能克隆与定位克隆；RNA干扰技术。复性RNADNA（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。（二）探针技术二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹

(SouthernBlotting)（二）RNA印迹(NorthernBlotting)（三）蛋白质的印迹

(WesternBlotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。其他：斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA点阵(DNAarray)DNA芯片技术(DNAchip)三种印迹技术的比较分子杂交实验①②③放射自显影照片第二节聚合酶链反应PolymeraseChainReaction5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

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TemplateDNA一、PCR技术的工作原理5

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ABababCycle35

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25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。5

5

3ˊ5ˊ待扩增片段Aa引物互补B链Bb引物互补A链a引物b引物第一周期：变性、退火、引物延伸第二周期：变性、退火、引物延伸。因为b互补A链，a互补B链，所以b相当于B链，a相当于A链，所以a是b链引物，b是a链引物。bAaB第三周期：变性、退火、引物延伸bbaababaPCR原理模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+

PCR体系基本组成成分PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C引物Tm值减5℃利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。二、PCR技术的主要用途（一）目的基因的克隆利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因突变ＧATＣ３，５，３，５，将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。（四）DNA序列测定（五）基因突变分析逆转录PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆转录PCR技术三、几种重要的PCR衍生技术原位PCR(insituPCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相一种最佳方法。（二）原位PCR技术

人染色体8q24·1显微切割的PCR产物的原位杂交图（三）实时PCR技术1、概念：实时PCR(real-timePCR)技术通过动态的方式监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入含荧光基团的探针引物，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。2、实时PCR技术原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物荧光标记引物RQ3'3'5'5'（荧光探针引物）*实时PCR用于基因拷贝数（模板数）分析的原理：①、Ct值的定义：（CyCleThreslold-Ct值）每个反应管内扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经历的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。（指对照与测定管，或不同条件下的PCR反应）②、Ct值与起始模板的关系

研究表明，每种模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数(模板数越多，Ct值越小）。利用已知起始拷贝数的标准品并可分别测得Ct值，作出标准曲线，其中横坐标代表起始模板拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（或相反）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始模板拷贝数。图示：

模板含量高，PCR循环圈数小，模板拷贝多，Ct值小含不同DNA拷贝数的样品达到规定的荧光强度域时所需的扩增循环圈数，即Ct值。每条曲线代表一种具已知拷贝数的样品。Ct值

横坐标：代表起始模板拷贝数的对数，纵坐标：Ct值Ct值：每个反应管内扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经历的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。如图，起始模板拷贝数（对数）越小，Ct值越大Log起始拷贝量与Ct呈线性关系，图示，含拷贝数越多的样品，Ct值越小。实时荧光定量PCR标准曲线Log起始拷贝量与Ct呈线性关系，从图可见，含拷贝数越多的样品，Ct值越小。③、RealTimePCR定量方法：绝对定量法：检测待测起始模板数的精确拷贝数，需事先制作标准曲线相对定量法：在待测样品的初始模板数（靶序列）相对于参照样品的量的变化。如可作Ct值的比较，即比较CT法。如比较原癌基因是否扩增，初始模板数是否增加？常用制作标准曲线的标准品：最好是含有与待测样品相同扩增片段的克隆质粒，或cDNA，还有纯化的PCR产物等标准模板浓度通常选5个点，浓度呈递减或递增的梯度变化总之，模板DNA的量越多，荧光达到规定的阈值时所需的循环次数就越少，即Ct值就越小；Log模板浓度与PCR荧光达到规定的阈值时所需的循环次数（Ct值）呈线性关系，通过已知起始拷贝数（浓度）的标准品，可做标准曲线，根据所测得的待测样品的Ct值就可通过标准曲线计算出样品（未知样品）中所含的模板量（初始拷贝数）。第三节核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis核酸序列分析的基本原理：化学裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA链的末端合成终止法(Sanger法)一、DNA链末端合成终止法GATC

测序反应

电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5'

3'

正极负极ddGddAddTddC链末端合成终止法测定DNA序列的原理1、可将待测模板制作成仅差1个碱基的寡核苷酸片段；2、高分辨率的PAGE可使仅差1个碱基的寡核苷酸片段有不同的泳动速度而分开。模板合成的序列：5，

TTACGTCAT3‘

AATGCAGTAGATC

测序反应

电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5'

3'

负极正极ddGddAddTddC链末端合成终止法测定DNA序列的原理ＴＴＡＣＧＴＣＡＴＡｄｄＡ×ＡＡＡ

ｄｄＡ×Ｃ

ｄｄＣ×

Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。2ˊ,3ˊ-ddNTP脱氧核糖的3ˊ位缺少羟基，（而该羟基它可以与下一核苷酸的5ˊ磷酸形成磷酸二酯键），因而不能与下一个核苷酸缩合，导致多核苷酸链的延伸终止。

如果在DNA的合成反应中，加入一种少量的ddNTP，则多核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列长短不一的核苷酸链。在每组独立的DNA合成反应中，分别加入1种ddNTP，结果生成的4组核苷酸链将分别终止于各个A，G，C，T的位置上。对这4组核苷酸链进行高分辨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（高压电泳），就可读出序列。

双脱氧末端终止法测序原理二、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。

ddGddAddTddC红色荧光绿色荧光黄色荧光蓝色荧光电泳DNA序列自动分析原理及结果图第四节基因文库GeneLibrary基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。一、基因组DNA文库基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有

噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。基因组文库和cDNA文库的构建和筛选cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。二、cDNA文库第五节生物芯片技术BiologicalChipTechnique是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)基因芯片工作流程示意图是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应蛋白质芯片(proteinchip)蛋白质芯片作用原理第六节生物大分子相互作用研究技术

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选常用蛋白质相互作用的研究技术标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。标签融合蛋白沉淀实验流程示意图（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途酵母活化因子GAL4baitprey酵母双杂交技术（THS、Y2Ｈ）概念：是一种用于筛选蛋白质与蛋白质之间相互作用的技术，主要通过将被研究的蛋白质融合到一个转录激活蛋白的两个独立的结构域之间(结合结构域与激活结构域）进行操作。

b.1989年，由Song和Field建立关于转录激活因子

酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当猎物蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究原理prey酵母活化因子GAL4BD基因AD基因转录调节因子结构DNA结合域转录激活域TF蛋白质-蛋白质结合域（二聚化结构域）谷氨酰胺富含域酸性激活域脯氨酸富含域酵母双杂交技术的应用

(1）、检验一对功能已知蛋白间的相互作用。

(2）、研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。通常需对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。其结果若与结构生物学研究结合则可以极大地促进后者的发展。(3)用已知功能的蛋白基因（诱饵蛋白）筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。(4)分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库。然后根据钓到的已知基因的功能推测该新基因的功能。电泳迁移率变动测定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gelshiftassay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，且已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术电泳迁移率变动测定A）DNAtobeanalyzed

复习题1、PCR的基本原理？PCR反应体系包括哪些组分?常用PCR有哪些及其应用。2、DNA测序需用哪些酶与底物？简述DNA测序的原理。3、简述酵母双杂交原理？钓饵蛋白和猎物蛋白的作用及如何证明蛋白质之间发挥了相互作用。4、比较转基因，动物克隆和基因敲除的概念。染色质免疫沉淀技术(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。（二）染色质免疫沉淀法染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图遗传修饰动物模型的建立及应用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel第七节转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。

转基因——被导入的目的基因转基因动物(transgenicanimal)——目的基因的受体动物一、转基因技术受精卵或着床前的胚胎干细胞活体组织检查核转移技术

即动物整体克隆技术，将动物的一个体细胞核全部导入另一个体的去胞核的的激活的卵细胞内，使之发育成个体，即克隆(clone)。二、核转移技术“多利”的诞生1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。世界上第个克隆羊—多利中国完成世界首例转基因克隆兔实验(图)

左为克隆兔，右为代孕兔。2007年12月14日09:20:43来源：科技日报中国首例异种克隆动物“北山羊”在新疆降生2004美国科学家成功克隆灵长类动物韩国培养出世界上首批克隆狗（一）、基本概念基因剔除技术(geneknockout)

也称基因靶向(genetargeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。三、基因剔除技术将灭活的基因放入胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES)中，使这一灭活基因通过同源重组取代原有的目的基因，筛选到基因已定点灭活的细胞后，通过显微注射将细胞注入小鼠囊胚中。细胞在小鼠囊胚中参与胚胎的发育，最终形成嵌合体小鼠。操作方式A、制备基因敲除的胚胎干细胞（同源重组）B、制备基因敲除动物（小鼠）（二）、基因敲除的原理与程序A、制备基因敲除的胚胎干细胞

1、打靶载体的构建：在一克隆载体上组装包括，待敲除的目的基因（同源臂），用于筛选的新霉素（Neor）基因和胸苷酸激酶基因(tk)

。2、将构建的打靶载体转入胚胎干细胞，(为使靶载体上的新霉素基因能与干细胞内的目标基因发生同源重组而剔除目标基因)。3、筛选基因敲除的胚胎干细胞待剔除基因克隆克隆载体重组载体切割基因使待剔除基因失去活性阳性标记基因Neor连接HSV-tk打靶载体褐色大鼠胚胎干细胞A、制备基因敲除的胚胎干细胞这样打靶载体包含了：1、部分待剔除的基因片段，（用于与野生型的该基因进行交换重组）2、阳性筛选标志基因（Neor，neomycin-resistancegene)、使细胞具有抵抗G418（能被新霉素抵抗基因的表达产物分解）的能力。3、阴性筛选标志基因即胸苷酸激酶(thymidinekinase-tk)基因，来自单纯庖疹病毒（HSV），当它在受体细胞内合成出tk时，可以分解细胞培养液中加入更昔洛韦，即gangcyclovir（一种环鸟苷酸底物)而产生有毒的分解物使细胞死亡，为阴性筛选标志。

在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时（联会），打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进行筛选鉴定。1231号发生位点同源重组，在G418培养基中生长；2号为随机插入重组，带入tk基因，可在G418培养基中生长，但在gangcyclovir培养基中被杀死；3号未发生任何重组，为正常细胞，在G418培养基中被杀死。抵抗G418的基因tk基因B、制备基因敲除动物（小鼠）1、将发生同源重组的胚胎干细胞导入来自黑色的小鼠胚泡中（形成嵌合体胚胎，两套基因物质）2、将胚泡植入假孕小鼠子宫中发育。3、诞生出杂合的嵌合体小鼠，具黑毛和褐色毛，胚胎干细胞来自褐色小鼠，正常胚胎来自黑色小鼠。4、嵌合体小鼠与野生黑色小鼠交配，产生纯黑色与纯褐色的后代小鼠，其纯褐色小鼠为杂合子，有一目的基因已被敲除。5、近亲交配，产生纯合子基因敲除小鼠（第四代）。打靶载体内切酶消化线性化打靶载体转染基因组同源重组同源重组的胚胎干细胞胚泡植入假孕小鼠杂合子小鼠正常小鼠杂合子小鼠交配杂合子小鼠兄妹交配纯合子小鼠（基因剔除）黑色雌性大鼠来自褐色大鼠B、制备基因敲除动物（小鼠）1、Neor

（neomycin-resistancegene)基因：阳性筛选标志，使细胞具有抵抗新霉素（G418）能力。2、胸苷酸激酶(thymidinekinase)的作用：阴性筛选标志，分解底物为gangcyclovir杀死细胞（自杀基因）新霉素抗性基因(neo)是真核表达载体的常用筛选标志,neo基因编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ),能催化G418、卡那霉素等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之失去抗菌活性建立动物模型目前已建立的动物模型如ß-地中海贫血，高脂蛋白血症，阿尔茨海默氏病等。四、基因转移和基因剔除在医学发展中的作用基因诊断和基因治疗第九节GeneDiagnosisandGeneTherapy（一）、定义直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。一、基因诊断(GeneDiagnosis)（二）、特点针对性强；特异性强；灵敏度高；适应性强DNA序列分析PCR技术（测序，限制酶酶切图谱）3、基因芯片(genechip)4、分子杂交（三）、基因诊断常用技术方法(四)、基因诊断的应用1、遗传疾病2、感染性疾病，传染性流行病3、肿瘤4、法医学应用，亲子鉴定等5、器官移植组织配型例：1、遗传性疾病如诊断地中海贫血，血友病，苯丙酮尿症，产前诊断等2、传染病如诊断HIV,SARS,乙肝病毒等，病原微生物3、对肿瘤的早期诊断：检测p53基因突变，17号染色体，据悉，人类恶性肿瘤50~60%与该基因突变有关，美国Affymeri公司已把p53基因核心区（结合结构域),酸性区（转录活化），碱性区（转化区）中的已知突变序列制作成了探针，集成在基因芯片上用以检测所有p53编码区的错义突变，及单碱基缺失，插入等，预测癌症的发生，早期诊断，主要检测5~8外显子，现已有检测肺癌的芯片